[发明专利]一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸序列，尤其是涉及一种一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法。

背景技术

在养殖业中，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。

目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。16SrRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SrRNA，专业技术水平要求较高，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体，由于制备技术要求较高、周期较长，使其应用也受到一定的限制。

指数富集配体进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。

哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性、发光的(并非所有菌株)海洋弧菌，菌体呈弧状，极生单鞭毛。它广泛分布于近岸温暖的海水、海洋沉积物、海洋动物的体表，也是许多海洋脊椎动物和无脊椎动物的正常菌群。但是在某些特定条件下，如水质恶化或环境异常等条件下常会引起养殖动物发病，是近些年来才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX技术筛选哈维氏弧菌和溶藻弧菌的共同适配子，将能同时识别检测哈维氏弧菌和溶藻弧菌，从而能大大提高哈维氏弧菌和溶藻弧菌检测的效率。

中国专利CN102199667A公开一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用，包括SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。

中国专利CN102329862A公开一种三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用，寡核苷酸序列包括SEQIDNo.1～3。将寡核苷酸文库与溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列；对获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。

发明内容

本发明的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法。

所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No.1(该序列又可记为“C7”)、SEQ ID No.2(该序列可记为“C8”)、SEQ ID No.3(该序列可记为“C14”)和SEQ ID No.4(该序列可记为“C22”)4条寡核苷酸序列，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；

所述SEQ ID No.1为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；

所述SEQ ID No.2为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；