[发明专利]一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法

权利要求书

1.一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，其特征在于包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4四条寡核苷酸序列，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；

所述SEQ ID No.1为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；

所述SEQ ID No.2为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；

所述SEQ ID No.3为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；

所述SEQ ID No.4为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′。

2.如权利要求1所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；

2)将寡核苷酸文库分别与哈维氏弧菌、溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；

3)SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；

4)选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体方法为：

2.1 弧菌菌液的制备

用生理盐水将哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围：1×10⁸～9×10⁸个/ml，于-20℃低温保存备用；

2.2 适配子的SELEX筛选，具体方法如下：

2.2.1 ssDNA与哈维氏弧菌的结合、分离，具体方法如下：

取100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μl自然室温恢复的哈维氏弧菌菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀，弃上清；在沉淀中再加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，然后15000rpm离心10min，取上清液，对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与哈维氏弧菌有亲和力的ssDNA次级文库；

所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1M NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、pH 7.4；

2.2.2 ssDNA与溶藻弧菌的结合、分离，具体方法如下：

将步骤2.2.1分离得到的能与哈维氏弧菌结合的ssDNA，再与100μl自然室温恢复的溶藻弧菌菌液，摇床结合30min，后续步骤同步骤2.2.1，则可分离到与溶藻弧菌和哈维氏弧菌都有亲和力的ssDNA次级文库；

2.2.3 不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下：

对步骤2.2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25μl的不对称PCR扩增体系为：

10×PCR缓冲液：2μl；

P1，10μM：1μl；

P2，0.2μM：1μl；

dNTP，各2.5mM：0.4μl；

MgCl₂，25mM：1.2μl；

ssDNA模板，0.2μg/μl：2μl；

Taq DNA聚合酶，5u/μl：0.2μl；

ddH₂O：17.2μl；

PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸7min；

2.2.4 亲和力的测定，具体方法如下：

2.2.4.1 扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2.2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；

2.2.4.2与菌结合：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100μL，95℃变性5min，冰浴10min后加入到室温恢复的100μL菌液中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2×结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作；

2.2.4.3 洗涤：将细菌沉淀用1×结合缓冲液500μL洗涤1次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；

2.2.4.4 与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μL 1∶900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应10min，使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合；

所述TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5～9g NaCl，再加Tris-HCl，0.5M，pH7.6，溶液100ml，最后加水定容至1L；0.5M Tris-HCl溶液，pH7.6，100ml，溶液配制方法：称取Tris 6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7.6，定容至100ml；

2.2.4.5 洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液500μL洗涤3次，得菌沉淀；

2.2.4.6 TMB(四甲基联苯胺)显色：加入400μL双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μL TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H₂SO₄ 200μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD₄₅₀，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD_结合，空白同样进行上述步骤2.2.4.3，2.2.4.4，2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相应的吸光度OD_空白；

所述TMB显色液的配制方法为：按体积比，1mg/ml TMB∶底物缓冲液∶30％过氧化氢＝100∶900∶1，其中1mg/ml TMB是将TMB用无水乙醇配成1mg/ml；底物缓冲液的配制：称取0.5103g柠檬酸、1.84g Na₂HPO₄·12H₂O与烧杯中，溶解后加入蒸馏水定容至100ml；

2.2.4.7 测定PCR产物中DNA的摩尔浓度：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出100μL PCR产物中的DNA摩尔数；

2.2.4.8 计算相应文库的亲和力：

2.3 重复筛选，具体方法为：

以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.2，直到亲和力不再上升为止，则最后一轮筛选得到的ssDNA次级文库即为筛选获得的适配子富集文库。