[发明专利]一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种微载体的回收处理方法，具体涉及一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法。

 

背景技术

大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。近十数年来，人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞，例如BHK-21(仓鼠肾细胞)、MDCK、Marc-145等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、猪瘟兰耳病疫苗等产品。现在，由于动物细胞培养技术在规模和可靠性方面都不断发展，且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的，因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。1967年，Van Wezel首次开发了微载体系统，创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。目前，Pharmacia公司生产的Cytodex系列应用最为广泛。

虽然，微载体广泛用于生物制品行业，但是由于我国微载体制造技术不成熟，还不能运用于生物反应器细胞高密度培养。国内使用的微载体均为进口产品，但是进口微载体通常存在价格高的问题，给我国生物制品的发展带来了极大的影响，尤其是兽用生物制品的发展。同时，这些进口的微载体多数是一次性载体，只有少数微载体才能够重复使用，但是重使用次数较少，例如GE Healthcare 公司的产品说明书建议其微载体使用次数最多不超过4次，并且没有给出有效的回收方法。目前，普遍采用的微载体回收工艺过于简单，造成了微载体表面的残留细胞碎片处理不干净，影响微载体的重复利用；由于没有形成有效的系统回收方法，大多数的微载体使用之后都没有进行回收再利用，造成了严重的浪费。

 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其包括以下步骤

（1）筛选：使用60-300目的筛网过滤除去溶液，回收微载体，并放置到容器中；

（2）溶剂稀释：向上述装有微载体的容器中加入2-5倍于微载体体积的浓度为0.1M的并含有浓度为10-50mM的EDTA的PBS溶液，再用医用酒精稀释至载体的体积浓度至20%；

（3）搅拌：将上述溶液进行中速搅拌；

（4）过滤：搅拌结束后，用筛网过滤回收微载体，同时从溶液中取出从微载体上脱落的的细胞碎片；

（5）氢氧化钠处理：将上述过滤后收集的微载体放入到容器中，然后加入1-2倍于微载体体积的浓度为0.1-1M氢氧化钠溶液，加入同时搅拌，搅拌过程中用显微镜检测微载体表面，至贴在微载体表面80-90%的细胞碎片脱落；

（6）调节pH值：搅拌停止后用筛网回收载体，并用0.1M的PBS冲洗载体，至溶液的pH值为6.5-7.5；

（7）酶消化处理：将上述微载体转入到容器中，加入1-2倍于微载体体积的蛋白酶溶液进行消化处理，消化期间不断搅拌，并用显微镜观察微载体表面，至微载体表面干净后停止消化；

（8）冲洗：将上述消化完成后的微载体用浓度为0.1M的PBS冲洗，直至PBS冲洗液中不再出现细胞碎片；

（9）灭菌处理：将上述冲洗后的微载体进行灭菌处理，之后用于细胞培养。

本发明中氢氧化钠的作用是除去微载体表面的蛋白，有助于提高微载体的回收效果。

由于盛装微载体的容器材质不能与微载体发生相互吸引，否则会造成微载体的损失，因此，优选的，本发明所述的装微载体的容器为硅化玻璃容器。

所述（3）搅拌步骤中，中速搅拌的速度为60-120转/分，搅拌时间为2-4小时。另外本发明中其他地方所提到的中速搅拌时，搅拌速度均为60-120转/分。

本发明中，所采用的氢氧化钠溶液优选的浓度为0.1-0.5M。

优选的，本发明中，所述的（7）酶消化处理步骤中，搅拌速度为10-50转/分。

为了避免颗粒较小的微载体丢失和提高溶液中其它物质例如细胞碎片过滤的效率，优选的，本发明中所述的网筛为150-200目的不锈钢网筛。

本发明中所采用的蛋白酶溶液是质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液。

本发明中，所述（7）酶消化处理步骤中，消化在室温下进行，消化时间为10-20h，搅拌速度为10-120转/分，在消化期间每隔1-2小时，使用显微镜观察微载体表面1次。