[发明专利]一种脱氧河鲀毒素的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脱氧河鲀毒素的提取方法，属于海洋生物技术领域。

背景技术

河鲀毒素(tetrodotoxin，TTX)是从河鲀鱼的内脏中提取出的一种毒性极强的非蛋白物质之一，具有独特的化学结构和药理性质，是一种著名的神经毒素；其毒性比氰化纳高1250倍。现代医学研究表明，河鲀毒素还广泛存在于虾虎鱼、蝾螈、章鱼、贝类、螺类、海星、蟹类等海洋生物体内。河魨毒素的结晶是一种氨基氢化喹唑啉类型化合物，分子式为：C₁₁H₁₇N₃O₈，分子量为：319.27。这种令人生畏的毒素，只需0.3mg-0.5mg就可致人于死地，因为它能专一地阻断神经细胞膜Na⁺通道，所以，河鲀毒素具有镇痛、戒毒、镇痉、镇痒、局麻等功效。多年来，河鲀毒素研发一直备受国内外科学家的密切关注。

脱氧河鲀毒素(deoxytetrodotoxin，deoxyTTX)是河鲀毒素的衍生物，是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，主要应用于神经生物学、生理学、药理学和其他科学研究。deoxyTTX与TTX在一般情况下同时存在于同一生物体中，都广泛存在于河鲀鱼、虾虎鱼、螺类、蓝环章鱼、蟹类、海星、海生陆产的两栖类、软体动物和节肢动物等海洋生物体内，并且，主要存在于河鲀鱼的卵巢、肝脏、皮肤和肠胃中。其中，deoxyTTX虽然分布于多种生物中，但是，在天然生物体中，deoxyTTX含量极微，在粗品TTX所含的多种衍生物中，deoxyTTX的含量也是非常少。而且，deoxyTTX与TTX所含的多种衍生物的分子量、分子结构、理化性质非常接近，因此，要单一提取deoxyTTX非常困难。目前，关于deoxyTTX的制取方法，尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种脱氧河鲀毒素的提取方法，该方法是在河鲀毒素的废弃母液中提取脱氧河鲀毒素；主要使用醇醚扩散法纯化河鲀毒素，不仅可提高河鲀毒素的纯度，同时可使脱氧河鲀毒素聚集于母液中，以该母液为原料，通过色谱分离和层析脱盐方法处理后，达到提取脱氧河鲀毒素的目的；该制备方法工艺简单，生产成本低，容易实施，同时可使精制河鲀毒素后的废弃母液得到了充分的利用。

为了达到上述目的，一种脱氧河鲀毒素提取方法按下列步骤提取的：

一、制备河鲀毒素母液

先将粗品河鲀毒素置于玻璃烧杯中，加浓度为7％-15％的醋酸溶解，得到“A”溶液，在“A”溶液中加入剂量为“A”溶液量1-10倍的无水乙醇，搅拌均匀，溶解后得到“B”溶液，将“B”溶液通过离心机分离，除去其中的不溶物，得到河鲀毒素上清液；将河鲀毒素上清液倒入烧杯后，移到密闭容器中，然后在密闭容器内放置一杯乙醚溶液，将密闭容器内的温度控制在10℃-35℃；当乙醚向河鲀毒素-醋酸-乙醇-水溶液扩散后，经过10-60小时的反应，即可析出河鲀毒素结晶，得到母液“C”；

二、高效液相色谱分离

将母液“C”真空加热浓缩后，加入氨水将母液“C”pH值调节至7.5-10后，析出沉淀物，将此沉淀物通过水洗、真空冷冻干燥处理后，即可获得白色的含脱氧河鲀毒素沉淀物；将此白色的含脱氧河鲀毒素沉淀物加入浓度为20％-30％的醋酸或磷酸溶解，得到“D”溶液；使用高效制备液相色谱仪对“D”溶液进行液相色谱分离，色谱条件：C₁₈反相柱；流动相为含有1mmol/L-15mmol/L离子对试剂的0.05mol/L-0.5mol/L缓冲液和0.5％-5％甲醇，其流动相的流速为6mL/min-15mL/min；使用示差折光检测器或紫外检测器进行检测；在高效液相色谱分离过程中，按出峰图谱可收集到脱氧河鲀毒素的馏分；

三、层析脱盐处理

将上述脱氧河鲀毒素馏分，缓慢加入装有生物凝胶或酸性阳离子树脂的层析柱中，再用浓度为3％-20％的醋酸溶液进行洗脱，收集pH值为4-7的馏分；然后使用氨水将此馏分的pH值调节至7.5-10，即可析出白色固体；将白色固体经过水洗和真空冷冻干燥处理后，即可得到纯度较高的脱氧河鲀毒素结晶。

所述的离子对试剂包括辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠、戊烷磺酸钠。

所述的缓冲液可使用磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。

所述的流动相的pH值为5-7。

脱氧河鲀毒素的具体提取方法(试验例)

一、制备河鲀毒素母液