[发明专利]检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法

说明书

发明领域

本发明涉及生物医学领域，特别是一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法。 

背景技术

现有的猪链球菌检测方法有微生物学方法、血清学鉴定及PCR检测等。微生物学检测方法是根据细菌的形态、培养特性和生化特性等进行鉴定。链球菌在显微镜下呈圆形或卵圆形，直径小于0.2μm，常成双排列或成链状。革兰氏染色阳性，除D群个别细菌外，均无鞭毛，多数有荚膜。血琼脂平板上可长成直径0.1～1.0mm，灰白色、表面光滑、边缘整齐的小菌落，多数致病菌株具有溶血能力，溶血环的大小和类型因菌株而异。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、协同凝集试验、毛细沉淀或平板凝聚试验, 其中ELISA与协同凝集试验的应用最为广泛。PCR检测方法有很强的特异性和高度的敏感性。 

基因芯片作为检测手段，有高灵敏性、高度精确性、高信息量等优点，被应用于多种微生物的检测中， 已建立有针对猪病致病菌的基因芯片的检测方法，但需要对已点样的芯片进行水化和预杂交处理，且所需杂交探针的浓度较高，检测成本高。 

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法，可有效解决现有检测设备及方法耗时长，投入大的问题。 

本发明的技术方案是：设计并合成引物和探针，用灭菌水溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片（公知市售产品）上接触式点样，制备用于检测猪链球菌2型的基因芯片。 

本发明还提供了用于检测猪链球菌2型的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：提取待测猪链球菌2型细菌的基因组DNA，采用不对称PCR制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果。 

本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需半小时，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用5μm/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。 

附图说明

图1为本发明2型猪链球菌基因芯片点样示意图。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明具体实施方式作进一步详细说明。 

一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计引物和探针：以猪链球菌2型（菌株号为S735，GenBank序列号为AF118389）的cps2J基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物：5’-TGGAATACGCA GAGCAA GAT-3’，下游引物：5’Cy3-AGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’，探针：5’NH2-TTTTTTTTTTTTT TTT-ACGG TATCAAAAATAGCACAGCAAA-3’，在下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上16个T； 

（2）对引物和探针进行合成：将步骤（1）所设计的引物和探针，交公司进行合成（这是公知的合成途径）；

（3）基因芯片的制备：用灭菌水溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片（公知市售产品）上接触式点样，点样完毕后将芯片静置于25-30℃烘箱干燥过夜8-12小时。

一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待测猪链球菌2型细菌的基因组DNA； 

（2）杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，所述的反应体系为：10×Buffer为2.5μl，上游引物（20μM/L）为0.2μl，下游引物（20μM/L）为0.5μl，dNTP(10mmol/μl)为2.0μl，模板DNA 1.0μl，ExTaq^TM酶为0.3μl，ddH₂O为18.5μl，总体积为25μl ，PCR扩增反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性45，56℃退火45s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min；