[发明专利]检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法

权利要求书

1.一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计引物和探针：以猪链球菌2型的cps2J基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物：5’-TGGAATACGCAGAGCAAGAT-3’，下游引物：5’Cy3-AGCAAGTAACCCTCCCG ACA-3’，探针：5’NH₂-TTTTTTTTTTTTTTTT-ACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAA-3’，在下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上16个T；

（2）按常规方法对引物和探针进行合成；

（3）基因芯片的制备：用灭菌水溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪（按预先设定好的程序）在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将芯片静置于25-30℃烘箱干燥过夜8-12小时。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述的引物浓度为20μM/L。

3.根据权利要求1所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述探针浓度为5μM/L —20μM/L。

4.根据权利要求1所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的制备方法，其特征在于，点样环境参数为相对湿度55-65%，温度15-30℃，各探针点间距为1.5mm，点样阵列根据实验要求设定。

5.一种用于检测猪链球菌2型的基因芯片的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测猪链球菌2型细菌的基因组DNA；

（2）杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，所述的反应体系为：10×Buffer为2.5μl，上游引物（20μM/L）为0.2μl，下游引物（20μM/L）为0.5μl，dNTP(10mmol/μl)为2.0μl，模板DNA 1.0μl，ExTaq^TM酶为0.3μl，ddH₂O为18.5μl，PCR扩增反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性45，56℃退火45s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min；

（3）杂交用PCR产物与权利要求1所述的基因芯片杂交：将杂交用PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取PCR扩增产物20μl和杂交缓冲液180μl加于离心管中，混匀后取该混合液加到芯片的点样区，尽量避免产生气泡，将芯片放入杂交盒内，置于42℃水浴锅中避光杂交30min；

（4）基因芯片的洗涤与干燥：基因芯片的洗涤应在暗室中完成，杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用洗液1、洗液2、洗液3各洗涤2min，离心干燥；

（5）基因芯片的结果分析：将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值，基因芯片杂交结果判定的依据如下：模板DNA的PCR扩增效果良好；信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。

6.根据权利要求2所述的用于检测猪链球菌2型的基因芯片的使用方法，其特征在于， 所述的杂交芯片洗涤所用洗液1为1×SSC和0.2%SDS；洗液2为0.1×SSC和0.2%SDS；洗液3为0.1×SSC。