[发明专利]一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及菠萝蛋白酶的提取方法，特别涉及一种用壳聚糖羧化衍生物提取果菠萝蛋白酶的方法。

【背景技术】

菠萝蛋白酶(简称菠萝酶)是从菠萝植株中提取的一类多肽水解酶的总称，主要存在于菠萝茎和果实中。根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶(EC3.4.22.32)和果菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.33)。从菠萝皮、果中提取的为果菠萝蛋白酶，从菠萝茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。本发明是针对果菠萝蛋白酶的分离提取。

菠萝蛋白酶属于巯基蛋白酶，具有很强的水解活性，在食品、生物化学领域有广泛应用。同时，由于其能加强体内纤维蛋白的水解作用，将阻塞于组织的纤维蛋白及血凝块溶解，促进药物对病灶的渗透和扩散，且不破坏凝血所必需的纤维蛋白原，因而在医药领域也有很好的应用前景。目前，受酶活力低和原料供应不稳定的限制，其在医药领域的应用还未完全开发。

目前提取菠萝蛋白酶的方法可归为三类，即：盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法。

盐析法，如张桂香(张桂香，王元秀，矫强，等.盐法提取菠萝蛋白酶的研究.食品工业科技，2004，(6)：103-104.)报道了用(NH₄)₂SO₄沉降提取菠萝蛋白酶的方法。其提取菠萝蛋白酶的工艺步骤为：菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加苯甲酸钠-10℃加白陶土-吸附沉降-收集沉淀物-复溶-加(NH₄)₂SO₄-洗脱-粗酶液-调节pH-精酶液。简化的盐析法在小型企业中比较常见，具体步骤为：菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加(NH₄)₂SO₄-收集沉淀-干燥。盐析法所得酶的活力低，盐使用量多、如(NH₄)₂SO₄的添加量一般为菠萝汁体积的20-25％，(NH₄)₂SO₄不易回收，菠萝汁也不能回用，工艺比较落后。

有机溶剂沉淀法，如中国专利CN101696404A提供了一种通过有机溶剂沉降来提取菠萝蛋白酶的方法。菠萝经清洗榨汁后，滤液用聚丙烯酸吸附沉降，沉淀物用醋酸钙溶液处理，使菠萝蛋白酶游离出来，得到菠萝蛋白酶粗酶液，再经透析、冷冻干燥后，得到菠萝蛋白酶干粉。这种方法操作简单、快速、高效、分离量大、聚丙烯酸原料来源广泛，但实际操作中，聚丙烯酸受其单体制备方法的影响，其中常残留丙烯酰胺，这是一种有毒有害成分，在食品等行业中是限制使用的，且聚丙烯酸具有成膜性，能快速地在溶液中形成分子膜，阻碍透析的进行，不利于菠萝蛋白酶的纯化。

超滤法，如中国专利CN1908165A提供了一种超滤法提取菠萝蛋白酶的方法。它包括以下步骤：原料-清洗-粗粉碎-细粉碎-预处理-榨汁-离心-冷冻-过滤-超滤-干燥-成品，该工艺依靠先进分离提取手段，所用人工较少，酶活力也较高，缺点是菠萝汁不经去糖、去杂碎细胞处理，直接超滤，超滤膜易被污染，每次使用前后都要进行清洗，清洗时间超过生产时间，而且重复使用效果差，需频繁更换膜块，生产成本较高。

因此，目前还需要提供一种提取菠萝蛋白酶的方法，该方法能够解决盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法提取菠萝蛋白酶存在的不足。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种原料是纯天然产物、无毒无害、来源广泛，工艺操作简便、生产效率高，产品纯度好、活力高的菠萝蛋白酶的提取方法。

具体地说，本发明提供了一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法。

该方法包括如下步骤：

(1)壳聚糖羧化衍生物的制备；(2)菠萝汁预处理；(3)菠萝蛋白酶的吸附；(4)菠萝蛋白酶的洗脱；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥。

该方法可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝汁两种产品，二者的生产互不干涉，且菠萝汁透明澄清，无需离心等处理，可直接回收再利用.

本发明的具体实施方案如下：

(1)壳聚糖羧化衍生物的制备：称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成一定浓度的悬浮液，边搅拌边向其中加入适量的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液，将该溶液置于一定温度下的水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入适量的固体氯乙酸，反应一定的时间后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在适当的温度下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物；