[发明专利]一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)壳聚糖羧化衍生物的制备：称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成一定浓度的悬浮液，边搅拌边向其中加入适量的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液，将该溶液置于一定温度下的水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入适量的固体氯乙酸，反应一定的时间后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在适当的温度下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物；

(2)菠萝汁预处理：将菠萝果皮清洗后榨汁，过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积，然后将其置于适当温度下的冷藏罐中，向其中加入适量的粉末NaHSO₃、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)，缓慢搅拌均匀；

(3)菠萝蛋白酶的吸附：称取适量的步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物；

(4)菠萝蛋白酶的洗脱：配制适量的一定浓度和pH的NaHCO₃溶液，将步骤(3)得到的复合物溶于NaHCO₃溶液中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至一定的范围，再向其中加入适量的一定浓度的CaCl₂溶液，搅拌均匀后静置一定的时间，然后在3000rpm条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液；

(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥：配制一定浓度和pH的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释一定的倍数，在一定的温度条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为10K的超滤浓缩一定的倍数，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶，盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于一定的温度下，调节溶液pH至一定的范围，边缓慢搅拌边向其中均匀地加入适量粉末(NH₄)₂SO₄，然后静置一定的时间，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉。

2.根据权利要求1所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(1)所述的壳聚糖异丁醇悬浮液的质量浓度在0.8～1.1％的范围内；饱和NaOH溶液的用量在其溶质质量为壳聚糖的0.65～0.80倍范围内；固体氯乙酸的用量在壳聚糖质量的1.1～1.3倍的范围内；反应温度在65～75℃的范围内；反应时间在2.5～3.0小时的范围内；烘干温度在60～70℃的范围内。

3.根据权利要求1所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(2)所述的菠萝汁预处理，过滤后的菠萝汁需置于8～14℃的冷藏罐中，单位体积菠萝汁中粉末NaHSO₃、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)的加入量分别在3×10^-4～4×10^-4g/L、5.5×10^-5～6.5×10^-5g/L和4.5×10^-4～5.5×10^-4g/L的范围内。

4.根据权利要求1所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(3)所述的单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的加入量在1～3.5g/L的范围内。