[发明专利]禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

禽脑脊髓炎又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus，AEV)引起的一种主要侵害雏鸡的传染病，其特征性病理变化为非化脓性脑脊髓炎，典型症状为运动失调，头颈震颤和渐进性麻痹(赵振华、禹旺盛、郝宪谱等.禽脑脊髓炎的发生与诊断.内蒙古畜牧科学.1994，3：34-37)。世界几乎所有饲养商品鸡的地区都发生过该病，我国自上世纪80年代以来各地陆续暴发此病，给养禽业带来较大的经济损失。由于本病具有突然出现，难以预测持续期，可通过水平接触和垂直传播等特点，所以对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过对产蛋种鸡接种疫苗来预防后代雏鸡的发病。目前国内对禽脑脊髓炎疫苗的研究大多集中在灭活疫苗的研制，国外为弱毒活疫苗的研究报道。

AEV是小RNA科肠病毒属成员，基因组为单链正股RNA(Calnek，B.W.，Luginbuhl，R.E.，Helmboldt，C.F.，1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry.Iowa State University Press，Ames，IA，pp.571-581)。AEV仅有一个翻译起点，编码产生一个多聚蛋白，多聚蛋白在病毒编码的活性蛋白的作用下，级联水解成功能性蛋白，VP1是病毒的四种结构蛋白中的一种，与病毒的侵入及参与构成病毒的抗原成分有关。新加坡的Li Wei(2008)最近报道用细胞表达的VP1亚单位疫苗能有效地保护鸡免受AEV的感染。他们将AEV的主要抗原蛋白VP1、VP0、VP3分别在细胞SF9中进行表达，然后纯化蛋白，制成亚单位疫苗，并对VP1、VP0和VP3生物活性进行了检测，结果发现：VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保护鸡免受AEV的感染(Wei L，Chee LL，Wei T et al.The VP1 protein of avian encephalomyelitis virus is a major host-protective immunogen that serves as diagnostic potential.J Virol Methods.2008Apr；149(1)：56-62.)。

完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。

通过对禽脑脊髓炎病毒VP1 cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列，构建了原核表达载体，进行原核表达，并成功地表达出可溶性的重组蛋白。

利用本发明可以生产出禽脑脊髓炎亚单位疫苗，具有商业使用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白的基因合成、表达载体构建及产物的制法，以求在大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗。

实现本发明的技术方案为：

1.构建一种可表达禽脑脊髓炎VP1蛋白的基因工程大肠埃希氏菌将含有所禽脑脊髓炎VP1蛋白基因(序列1)连入克隆载体PM-18T，并转入大肠埃希氏菌DH5α；将鉴定正确的阳性质粒pMD18-T-VP1，用ECORI和SalI双酶切后，经1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收到VP1基因；回收的VP1基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VP1蛋白基因的表达载体pET-32a-VP1，转化表达型大肠杆菌(Escherichia coli)Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎VP1蛋白的基因工程大肠埃希氏菌pET-32a-VP1/Rossetta株。

2.制备的禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗利用构建获得可表达禽脑脊髓炎VP1蛋白的基因工程大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pET-32a-VP1/Rossetta株作为生产菌株，制备脑脊髓炎VP1蛋白和常规矿物油佐剂而成禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗。