[发明专利]一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病检测，具体涉及一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒用途，适用于检测猪血清中的伪狂犬病毒gE蛋白抗体水平。

技术背景

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失，猪是本病的天然宿主和储存者。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在伪狂犬病的根除计划中，监测和检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体是非常重要的一个环节。因为目前市面上的伪狂犬疫苗基本上都是gE基因缺失的疫苗，接种疫苗的猪只，血清中不含有猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体。如果检测出了gE蛋白抗体，说明猪已经被伪狂犬病病毒的野毒感染。可将感染的猪淘汰，彻底根除伪狂犬病。

目前国内检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体一般采用间接ELISA方法等，这些方法敏感性不高，因次不可避免会对实际结果造成误判。

本发明应用猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体及阻断ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的优点是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的的单克隆抗体，提高了检测的灵敏性和特异性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒的应用。将猪伪狂犬病毒作为抗原包被于ELISA板上，然后加待检血清孵育，再加入酶标记的猪伪狂犬病毒gE单抗，显色时应出现两种情况，如果待检血清是阳性，那么此时加入的酶标单抗就会被阳性血清中的抗体阻断，酶标仪检测数值就会越低。如果是待检血清阴性，那么酶标单抗就会继续与ELISA板上猪伪狂犬病毒抗原反应，得到的数值就会越高。该试剂盒特异性好、敏感性高。与美国IDEXX公司猪伪狂犬病毒gI蛋白抗体ELISA试剂盒的检测符合率为97％。有着良好的应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的杂交瘤细胞株2E6分泌的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株(该伪狂犬病毒鄂A株来源见参考文献：陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998年02期)。

所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液。

所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。

所述的阳性对照为猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清。

所述的洗涤液为含有0.05％体积比Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液。

所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。

所述的样品稀释液液为含2.5mg/mL的明胶的DMEM培养基。

所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术(参见文献：沈关心、周汝麟，现代免疫学实验技术，武汉：湖北科学技术出版社，，1998)，用纯化的猪伪狂犬病毒(鄂A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT(购自SIGMA公司)选择性培养基进行培养后，再用猪伪狂犬病毒鄂A株和伪狂犬病gE/gI基因缺失株(参见中国发明专利申请公开说明书，专利申请号200510019513.8)进行间接免疫荧光筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清和猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗免疫的阴性对照血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为2E6。

一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是：