[发明专利]抗HBV的化合物的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体而言，本发明涉及以乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶位点的药物筛选方法。 

背景技术

慢性乙型病毒性肝炎感染是严重危害人类健康的全球性感染疾病。在中国，乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病位列全国十大死因之一，严重影响了人们正常的工作和生活。目前，上市的小分子抗乙型肝炎病毒药物主要为核苷类药物，如拉米夫定、恩替卡韦等，尽管这些药物在抑制病毒复制上都卓有成效，但由于现有核苷类抗乙型肝炎病毒药物的作用靶点单一(HBV DNA聚合酶)，长期使用存在的耐药突变等问题。因此，寻找不同于核苷类抗HBV药物作用机制的新靶点，研发治疗乙型病毒性肝炎新型药物，尤其是非核苷类小分子抗HBV药物，是重要和紧迫的任务。已报道的非核苷类小分子抗HBV活性化合物有：异芳香二氢嘧啶(HAP)系列化合物，代表性化合物BAY38-7690，它同核心蛋白的113-143位氨基酸残基作用而干扰核心蛋白的组装过程，导致核心蛋白单体在细胞内过度累积而被降解；疏水性荧光探针bis-ANS能与核心蛋白结合，使之形成非壳体化的大分子多聚体，误导核心蛋白的正常装配过程，造成病毒基因组复制缺陷；苯丙烯酰胺类化合物AT-61和AT-130能够促进核心蛋白的组装速率，使得pgRNA来不及被包装，从而使得HBV-DNA复制水平降低；塞菊芋黄素同系化合物8-1能特异性地干扰宿主细胞的核转录因子与HBV启动子的相互作用，下调病毒RNA的转录水平。 

HBV核心蛋白C末端共计34个氨基酸，为鱼精蛋白样结构，其中有16个精氨酸，形成有3个SPRRR序列与4个精氨酸聚集区，为高碱性末端，可结合前基因组RNA与聚合酶复合物(pgRNA-Pol)启动核壳体包装。目前 尚未见有报道将核心蛋白C末端氨基酸作为药物作用靶点进行抗HBV药物的筛选。 

重组DNA技术是分子生物学中常用的一种生物技术，是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。本发明通过重组DNA技术构建多种真核表达质粒来表达C末端缺失、截短或突变的核心蛋白，确定核心蛋白C末端4个带正电荷的精氨酸富集区域(RRRDRGR、SPRRR、SPRRRR和SPRRRR)为关键靶点，以此筛选的化合物能有效的诱导形成空载病毒颗粒，从而抑制病毒复制。 

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明人进行了广泛深入的研究，并最终完成了本发明。 

本发明的目的是提供一种抗HBV的化合物的筛选方法。 

根据本发明的目的，本发明提供了一种抗HBV的化合物的筛选方法，其中，该方法以HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶点来筛选抗HBV的化合物，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。 

本发明中，优选地，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列可为： 

STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC、 

STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQ、 

STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTP或 

STLPETTVVRRRDRGR。 

具体地，所述方法包括以下步骤： 

(a)通过PCR的方法构建含有HBV核心蛋白C末端氨基酸序列的真核表达质粒，其中，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。 

(b)用步骤(a)中所得质粒瞬时转染肝癌细胞(Huh7细胞，HepG2细胞等细胞系，优选为Huh7细胞)4～6小时后给予筛选化合物处理48～96小时。 

(c)药物处理后收集细胞，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常空载HBV核心颗粒包装的化合物。 

本发明中，优选地，所述步骤(b)中筛选化合物处理为：将转染的肝癌细胞或与筛选化合物共同培养，所述化合物的浓度可以根据需要而进行设定。