[发明专利]在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)由Tischer于1974年在连续传代的PK15细胞株(PK15 ATCC CCL31)中首次发现，当时被认为是一种无致病性的细胞污染物，随后即被证实是一种无囊膜、直径为17nm的新病毒。这种圆环病毒广泛存在于PK15细胞中且不引起猪的临床症状，因而被称为猪I型圆环病毒(PCV1)。断奶后仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)于1991年首先发现于加拿大西部，到1994年已广泛流行于该国，现已在美洲和欧洲的许多国家和地区流行，亚洲地区的印度、日本、韩国、菲律宾、中国台湾省等也有此病的报道。PMWS主要感染7～15周龄猪，患猪表现为渐进性消瘦，淋巴结肿大，皮肤苍白或有黄疸等症状；猪群发病率为5～50％，死亡率接近100％，严重威胁世界各国的养猪业。现已证实该病是由一种致病性猪圆环病毒引起的，并将该圆环病毒命名为猪II型圆环病毒(PCV2)。我国朗洪武等于1999年在北京、河北等地某些猪场中也检测到猪圆环病毒的存在，此后国内许多实验室也相继检测到该病毒。

两型猪圆环病毒在分类上属于圆环病毒科，被列入该科的既有动物病毒，也有植物病毒。PCV1基因组全长1759bp，PCV2基因组全长1768bp(或1767bp)。PCV1与PCV2型内的同源性都在90％以上，但两型间同源性小于80％。已有研究表明，两型PCV的基因组均含有11个潜在的开放阅读框架(Open readingframe，ORF)。其中ORF1、2、3、6和7具有一定的同源性，而其余ORF无任何同源性。ORF1、2为两个主要的ORF，对其功能研究较为清楚。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白；ORF2编码的蛋白为病毒的主要结构蛋白-核衣壳蛋白，具有较好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法。

在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法的步骤为：

1)猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆；

2)含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建；

3)将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132；

4)继续培养48小时后，通过抑制蛋白酶体的活性，稳定真核细胞中的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆步骤为：收集SX0株感染仔猪的淋巴结组织，抽提病毒基因组DNA，用长距离精确PCR扩增基因组DNA全长，克隆于pGEM-T easy，获得重组载体pGEM-T-PCV，并行序列测定，测定的序列在GenBank登录号为AY604430.1。

所述的含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建步骤为：根据猪圆环病毒2型SX04株基因组序列，GenBank登录号：AY604430.1，设计核衣壳蛋白基因上下游引物：pcvCapNhe：CGACGCT AGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTAC，pcvCapMlu：CTACGCGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGGGTTAAGTGGCGGGTCTTTAA；并在蛋白C端引入HA序列，作为蛋白标记，将获得的核衣壳蛋白基因，通过NheI和MluI连接入pCI-Neo真核表达质粒pCI-PCVCapHA，并进行序列测定。

所述的将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132步骤为：pCI-PCVCapHA质粒在脂质体Lipofectamine 2000介导下，转染猪肾细胞PK5，在转染后24小时，在细胞培养上清液中，加入MG132，浓度为5nM。

本发明相对于普通的真核表达方法，该方法可有效稳定真核细胞中的PCV2核衣壳蛋白。转染后72小时的蛋白免疫印迹检测显示，本专利使用的方法，可最高提高PCV2核衣壳蛋白的表达量在20倍左右。

附图说明