[发明专利]在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法有效
| 申请号： | 201210018722.0 | 申请日： | 2012-01-20 |
| 公开（公告）号： | CN102586326A | 公开（公告）日： | 2012-07-18 |
| 发明（设计）人： | 李龙;于涟;方立 | 申请（专利权）人： | 杭州贝尔塔生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/66 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 张法高 |
| 地址： | 310014 浙江省杭州*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 哺乳动物 细胞 高效 表达 圆环 病毒 型核衣壳 蛋白 方法 | ||
1. 一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，方法的步骤为：
1）猪圆环病毒2型 SX04株全基因组序列的克隆；
2）含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建；
3）将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132；
4）继续培养48小时后，通过抑制蛋白酶体的活性，稳定真核细胞中的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。
2. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型 SX04株全基因组序列的克隆步骤为：收集SX0株感染仔猪的淋巴结组织，抽提病毒基因组DNA，用长距离精确PCR扩增基因组DNA全长，克隆于pGEM-T easy，获得重组载体pGEM-T-PCV，并行序列测定，测定的序列在GenBank登录号为AY604430.1。
3. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建步骤为：根据猪圆环病毒2型SX04株基因组序列，GenBank登录号：AY604430.1，设计核衣壳蛋白基因上下游引物：pcvCapNhe：CgacGCT AGCAtgacgtatccaaggaggcgttac，pcvCapMlu：ctACGCGTttaAGCG TAATCTGGAACATCGTATGGGTAagggttaagtggCgggtctttaa；并在蛋白C端引入HA序列，作为蛋白标记，将获得的核衣壳蛋白基因，通过NheI和MluI连接入pCI-Neo真核表达质粒pCI-PCVCapHA，并进行序列测定。
4. 根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132步骤为：pCI-PCVCapHA质粒在脂质体Lipofectamine 2000介导下，转染猪肾细胞PK5，在转染后24小时，在细胞培养上清液中，加入MG132，浓度为 5nM。
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