[发明专利]一种铅离子荧光DNA探针及铅离子浓度的荧光测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及铅离子浓度的检测分析领域，具体地涉及一种铅离子荧光DNA探针及利用该探针进行铅离子浓度的荧光测定方法。

背景技术

铅是分布广、有蓄积性的环境污染物。铅是性质稳定的重金属元素，其对人体极为有害，尤其严重危害儿童的健康。随着工业和其他行业的迅速发展，人们对铅的大量使用，使得铅污染已经从职业环境向水、大气、食品、医药等人们的日常生活环境扩展。

在环境检测、口岸快速筛查、消费品安全、废水处理和工业过程中，对铅的灵敏、快速的筛查和准确的定量十分重要。目前，在分析实验室内对于痕量铅的主要测试方法集中在原子吸光光谱法（洪颖，陈国松，张红漫等，《广东微量元素科学》2004,11（4）62~66；许财钦，《中国公共卫生》，2005，21(3)，361），ICP-AES法（陈文新，方奕文，光谱实验室，2003(20) 4，495~497），ICP-MS法（陈虹，张素珍，吴小均，《安徽农业科学》，2010，38(23)，12509~12513）。这些方法对铅的检出限在10μg/kg~1mg/kg，而这些方法均需要大型设备和燃烧气，成本较高，不易微型化。双硫腙测定铅具有较好稳定性和高灵敏度（测定范围在10~ 400mg/kg），已建立了成熟的国标方法（GB7470-87《水质铅的测定双硫腙分光光度法》），但由于试验过程中涉及有毒有机溶剂，该方法不利于环境保护。

另一方面，纳米生物技术的快速发展为检测技术变革提供了新的方向。随着能够与金属离子选择性结合的离子载体纷纷出现，人们在此基础上发展了多种重金属离子的检测方法。脱氧核酶（DNAzyme）是一种具有使RNA水解作用的单链DNA分子，又称为催化性DNA，它可以通过体外筛选（SELEX）技术得到。部分脱氧核酶的活性与某些金属离子密切相关，且脱氧核酶具有易于合成和修饰、高稳定性和环境友好等优点（Lu Y．Chem．Eur．J．[J]，2002，8(20)：4588~4596；Li J．，Zheng W．，Kwon A．H．，et a1．．Nucleic Acids Res．[J]，2000，28(2)：48l—488；Xiao Y．，Rowe A．A．，Plaxco K．W．．J．Am．Chem．Soc [J]，2007，129(2)：262-263）。其中Yi Lu小组利用对Pb²⁺ 敏感的17E脱氧核酶（DNAzyme）分子开发了一系列检测Pb²⁺的荧光、比色传感器（Li J. et. al, J. Am. Chem. Soc., 2000, 122:10466-10467；Liu J. et.al., Anal. Chem., 2003, 75: 6666-6667）。这些传感器多是在17E 脱氧核酶及其底物链上标记荧光信号分子及猝灭分子，利用Pb²⁺切割后脱氧核酶构象变化导致的荧光信号变化来定量Pb²⁺浓度。这些传感器由于需要进行DNA链的双标记，甚至三标记，成本较高。同时，由于在室温下，切割后的底物链可能重新与17E 脱氧核酶杂交，为了获得较低的荧光背景，试验操作温度须严格控制在4℃以下，实验条件较严格。因此，现有利用17E 脱氧核酶及底物链多标记探针检测Pb²⁺的方法存在着操作难点多、不易推广等不足。

本发明解决了现有技术利用17E脱氧核酶检测Pb²⁺的方法中的实验条件要求高、需对DNA探针多次标记、操作复杂等缺点，提出一种由17E 脱氧核酶及FAM荧光素标记的底物链组成的单标记、高灵敏的新型铅离子荧光DNA探针，以纳米金胶作为FAM荧光素的猝灭剂，进行铅离子浓度的荧光检测。本发明不仅保持了17E脱氧核酶的高灵敏度、高特异性，还大大降低了铅离子的检测成本。

发明内容

本发明提出了一种铅离子荧光DNA探针，包括17E脱氧核酶以及底物链杂交组成的双链，所述底物链的5'末端以FAM荧光素修饰；

其中，所述17E脱氧核酶的序列为：

5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT -3'；

所述底物链的序列为：

5'-FAM-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3'；

所述FAM荧光素如以下结构式（II）所示。

本发明中铅离子荧光DNA探针，如以下结构式（I）所示。