[发明专利]一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检验检疫领域，通过将卵清白蛋白免疫实验动物获得多克隆抗体，建立卵清白蛋白双抗夹心ELISA检测方法。 

背景技术

食物过敏是对食物中蛋白质分子产生的一种不良免疫反应。流行病学调查显示, 25% 以上的人群受到过敏疾病的困扰。世界卫生组织(WHO )将牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、蟹、龙虾)、花生、大豆、核果类(杏、板栗、腰果等)及小麦这8类食物定为常见的过敏食物。 

鸡蛋中的蛋白质属于优质蛋白质，除了含有成年人所需要的八种必需氨基酸外，还含有婴幼儿必须通过膳食补充的组氨酸，更是唯一一个蛋白质生物价达100的天然食物。然而正是这些对人体相当有益的蛋白质却可能成为儿童患过敏性疾病的祸首。不仅是儿童，某些先天性遗传缺陷的成年人同样有着对鸡蛋过敏的烦扰。据报道，鸡蛋过敏的高危人群为婴幼儿和儿童，是儿童继发性营养不良的原因之一。 

迄今为止，鸡蛋过敏尚无特效疗法，严格避免食用带鸡蛋的食物是鸡蛋过敏患者的最佳选择。然而鸡蛋营养丰富，若从鸡蛋过敏患者的膳食中除去鸡蛋，势必造成其营养不均衡。而且，由于现在食物配料的多样化，使食物的组成变得十分复杂，鸡蛋过敏患者很难避免遭受危害，因此，鸡蛋过敏已经严重影响了部分人群的生活质量，甚至危急生命，值得我们去关注和研究。 

鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，目前公认蛋清中有4 种蛋白成分能与人类血清结合而引起过敏反应，为鸡蛋的主要过敏原，它们分别是卵类黏蛋白、卵白蛋白OVA、卵转铁蛋白和溶菌酶。 

目前国内检测卵白蛋白主要利用进口的酶联免疫检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，但是价格昂贵，而国内尚没有市售的OVA ELISA 检测试剂盒。一般企业为节约检测成本，只使用其检测疫苗原液及成品，无法广泛用于工艺评价。 

发明内容

本发明提供一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，目的是建立快速、有效、低成本的卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法。 

本发明采取的技术方案是： 

（一）抗卵白蛋白的单克隆抗体制备：

（a）采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方案：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；

（b）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆:

强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，2011年12月7日在地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×10⁸M^-1；

（二）制备抗卵白蛋白的多克隆抗体：

（a）用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西兰大白兔，免疫剂量为1mg/1mL/只，第一次免疫用弗式完全佐剂与等体积的卵白蛋白OVA乳化完全后于颈部及背部皮下结合后腿根部肌肉多点注射，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及免疫方法同第一次免疫，第三次加强免疫后10天耳缘静脉采血并分离血清，用双向免疫琼脂扩散方法测定血清效价，当血清效价达到2⁴及以上时，心脏采血并在37℃放置2h，4℃静置过夜后3000rpm离心20min，收集血清，即获得多克隆抗体；