[发明专利]一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法

权利要求书

1.一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，其特征在于包括下列步骤：

（一）抗卵白蛋白的单克隆抗体制备：

（a）采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方案：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；

（b）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆:

强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×10⁸M^-1；

（二）制备抗卵白蛋白的多克隆抗体：

（a）用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西兰大白兔，免疫剂量为1mg/1mL/只，第一次免疫用弗式完全佐剂与等体积的卵白蛋白OVA乳化完全后于颈部及背部皮下结合后腿根部肌肉多点注射，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及免疫方法同第一次免疫，第三次加强免疫后10天耳缘静脉采血并分离血清，用双向免疫琼脂扩散方法测定血清效价，当血清效价达到2⁴及以上时，心脏采血并在37℃放置2h，4℃静置过夜后3000rpm离心20min，收集血清，即获得多克隆抗体；

（b）多克隆抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵法纯化兔血清，具体操作如下：（1）1份血清加入3份醋酸盐缓冲液（pH 4.5），混合均匀后于30min内逐滴加入正辛酸，边加边搅拌，加入辛酸的量为75ul/mL兔血清，4℃静置1h；（2）4℃以12000rpm离心30min，弃沉淀收集上清并准确记录体积，加入1/10倍体积的PBS（0.01M，pH7.0），调pH至7.2,然后逐滴加入饱和硫酸铵至50%饱和，边加边搅拌，4℃静置2h；(3) 4℃,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积的PBS（0.01M，pH7.0）溶起，逐滴加入饱和硫酸铵至33%饱和,4℃静置2h；（4）重复第3步；5）4℃,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积的PBS（0.01M，pH7.0）溶起，并于4℃条件下在PBS（0.01M，pH7.0）中透析直到没有硫酸根离子为止；紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度，并分装保存至-80℃备用；

(c)辣根过氧化物酶（HRP）标记多克隆抗体

纯化后的多克隆抗体用一种活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记，标记方法按照试剂盒说明书进行，具体操作方法如下：（1）1mg HRP用50μL去离子水完全溶解后，加入50μL纯化后的多克隆抗体溶液，含有多克隆抗体100μg，混合均匀后加入10μL左右的启动剂，调pH至9.5；（2）4℃放置12h，加入少量的硼氢化钠，再加入终止剂，约3倍体积启动剂的量，调节pH至7.0左右；（3）加甘油至50%，-20℃保存备用；

(d)卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法

（1）用纯化后的单克隆抗体4E9（5μg/mL）包被ELISA板，100 μL/孔，4℃包被过夜；

（2）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；

（3）加入新鲜配制的1%脱脂奶粉，100 μL/孔，37℃包被1h；

（4）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；

（5）加入系列稀释的OVA标准品溶液或者待检样品及辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体（1:2000 倍稀释），各100μL/孔，37℃孵育1h；

（6）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；

（7）加入OPD底物溶液，100μL/孔，37℃避光反应15min；

（8）加入2M硫酸终止反应，50μL/孔；

（9）酶标仪492nm处读值，记录OD值；

（10）绘制标准曲线，计算待检样品中OVA含量。