[发明专利]一种以马铃薯为主要原料发酵高产漆酶的方法

说明书

技术领域

本发明采用的发酵菌株是2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株，本发明的特点是以成本价格低廉的马铃薯为主要原料发酵生产制备高活性的漆酶，用DMP法测酶活其发酵粗酶液的最高酶活可达60U/ml以上，且简便易行，所产漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等领域，属于生物技术领域。

背景技术

漆酶具有广泛的底物，不仅能催化氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质的毒性，还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性等，因此在纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等领域具有较大的应用价值而受到广泛的关注。

现有漆酶的研究表明，漆酶的制备多数局限在实验室制备，所制备的酶活力偏低且制备成本偏高，高活力的漆酶完全依赖进口且价格昂贵，这促使我们去探索研究低成本制备高活性漆酶的方法。

发明内容

本发明用2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3产漆酶的密孔菌属的野生菌株为生产出发菌株，研究出以价格低廉的马铃薯为主要原料发酵制备出高活性漆酶的方法，并可连续发酵，简便易行且降低了成本，所制备的漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等方面，来替代价格昂贵的进口漆酶。

本发明的技术方案：用2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3产漆酶的密孔菌属的野生菌株为生产出发菌株，经种子培养和以马铃薯为主要原料发酵制备出高活性漆酶的方法；工艺和配方为：

1)种子培养基

种子培养基：以质量体积浓度计：5％葡萄糖，1％酵母汁，0.5％蛋白胨。

接种工艺：取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，取一平板用10ml无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液.取1ml孢子悬液接入250ml规格的三角瓶，装液量为50ml。

培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子。

(2)发酵产酶培养基

发酵产酶培养基：马铃薯10-30％，葡萄糖2％，初始pH：自然。

马铃薯需切成片或块，加水煮20-30分钟，过滤取其汁。

发酵罐：规格为7L容量.实际发酵装液量为5L。

发酵参数：接种量6-10％，转速200r/min.温度30度.通气量每升发酵液1.0-1.4L/min，培养时间5天-7天。

根据上述条件，在7L发酵罐中进行发酵，发酵液的漆酶活力最高达60U/ml以上。

(3)酶活的测定方法

3mL反应体系中包括：0.5ml 10mmol/L的2，6-二甲氧基酚；2.4ml pH＝3.0的0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬素缓冲液；0.1ml粗酶液——发酵液经冷冻高速离心机10000g离心10分钟得到上清液并视酶活力稀释，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在469nm处测吸光值每隔5s读取一次吸光度值，一般持续进行1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活。酶活力定义：1分钟催化一微摩尔底物所需酶量，酶活性以U·L^-1表示。

本发明的有益效果：

本发明的发酵产酶方法与其它制备漆酶的方法相比较，具有如下特点：

1、发酵性能稳定，菌体易于培养.

2、产酶周期短，在第6天左右即可停止发酵.

3、生产成本低，产酶活力高，最高可达60U/ml以上.

4、粗酶性质稳定，以DMP为底物时，在酸性环境下能发挥最大催化功效，最适温度为55度，较耐热。

5、所制备酶作用底物广泛，有广阔的应用前景.

6、可连续发酵——即发酵第一罐产漆酶完成后，发酵罐中留下10-15％的发酵液，补加85-90％的发酵培养基，继续发酵产漆酶，此时第2罐发酵参数同2，但培养时间只需3天左右。

因此本发明所生产制备出来的漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等方面，来替代价格昂贵的进口漆酶。因此本发明有广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。

具体实施方式

实施例1