[发明专利]一种流感病毒疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种流感病毒疫苗的制备方法。

背景技术

流感病毒感染导致急性呼吸道传染病-流行性感冒，给人类健康和社会生活造成严重危害。流感病毒类型多、变异快，当新亚型病毒出现时，人群特异性免疫往往难以奏效。

接种流行株疫苗是预防流感流行、保护易感人群最经济、有效的手段。目前获得批准生产的流感疫苗主要是鸡胚来源的灭活疫苗，这种疫苗存在诸多不足，如生产成本高、周期长，过敏反应，鸡胚连续传代可导致病毒抗原性变异，鸡胚还存在可能的外源因子的污染等，特别是如果禽流感爆发，鸡群大量死亡，鸡胚供应及产量会成为瓶颈。因此，世界卫生组织积极推荐各国发展哺乳细胞培养的流感病毒疫苗的制备。

目前，多种哺乳细胞被应用于一些病毒性疫苗的生产，Vero细胞全球公认，MDCK细胞美国、欧洲认可。而MDCK细胞又被公认为是培养流感病毒最合适的细胞系，该细胞比目前所知的其他细胞对流感病毒更敏感，短时间即可获得较高滴度的病毒，同时保持流感病毒抗原的稳定性，但MDCK细胞对于每年WHO发布的流感疫苗病毒株不是全能的敏感，而使得生产的病毒滴度仍有不确定性已成为疫苗生产的瓶颈。有文献报道同种哺乳细胞表面存在的流感病毒受体的类型和数量是不同的(Govorkova EA，Murti G，Meignier B，Taisne C DE，Webster RG.African Green Monkey Kidney(Vero)Cells Provide an AlternativeHost Cell System for Influenza A and B Viruses.J Virol，1996，70(8)5519-5524.)，因此，建立细胞单克隆库，筛选病毒敏感的单克隆株，获得病毒适应性细胞单克隆，提高病毒产量，可为工业化生产流感疫苗奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流感病毒疫苗的制备方法，提高流感病毒产量，使其适用于工业化生产。

一种流感病毒疫苗的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)哺乳动物细胞单克隆库的建立

将哺乳动物细胞在培养瓶中培养，待细胞生长至汇合度70-90％，用含EDTA的胰蛋白酶消化并计数，取100个细胞稀释至20ml细胞培养液中，混匀，接种于96孔板，每孔200μl，置37℃细胞培养箱中培养，待细胞长至40-60％汇合度，消化后转移至24孔板中继续培养，每一株单克隆化细胞转移至一孔，待长至85-95％汇合度后消化、转移至两个24孔中继续培养，待长至85-95％汇合度将细胞进行冻存；

(2)病毒高适应性细胞单克隆株的筛选

取单克隆细胞接种至24孔板，培养过夜，吸弃培养液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及TPCK-Trypsin，37℃培养48-90h后测定细胞培养上清中的血凝滴度，血凝滴度大于2⁸为病毒高适应性细胞单克隆株；

(3)优化病毒培养条件

取病毒高适应性细胞单克隆株铺至24孔板中，培养过夜，分别优化病毒培养的温度、收获时间、添加TPCK-Trypsin的量和感染指数MOI，获得病毒在病毒高适应性细胞单克隆株中最佳生长参数；

(4)在生物反应器中培养病毒高适应性细胞单克隆株，培养48-90h后收集培养液，收集的培养液经超滤膜包浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化、超离脱糖、灭活，测定血凝素含量后配制成单价或多价流感疫苗。

所述哺乳动物细胞为狗肾细胞MDCK、非洲绿猴肾细胞Vero、PER.C6细胞或人二倍体细胞。

所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。

所述生物反应器培养病毒高适应性细胞单克隆株的方式为微载体悬浮培养或无载体悬浮培养。

所述微载体悬浮培养中的微载体为葡聚糖微载体，用量为10-20g/L。

本发明的有益效果：本发明通过建立细胞单克隆库、筛选病毒高适应性细胞单克隆株、应用大规模生物反应器进行大规模细胞培养的方法生产流感病毒疫苗，克服传统鸡胚生产流感疫苗生产成本高、周期长，过敏反应、鸡胚连续传代可导致病毒抗原性变异等缺点，大大提高病毒产量，安全、有效、稳定。

附图说明

图1为MDCK单克隆细胞株培养甲型H1N1流感病毒疫苗株的血凝滴度检测。

图2为大规模培养的病毒适应性细胞单克隆株在微载体cytodex 3上生长的显微照片。

图3为细胞培养的流感病毒纯化后的电镜照片。