[发明专利]一种流感病毒疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种流感病毒疫苗的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)哺乳动物细胞单克隆库的建立

将哺乳动物细胞在培养瓶中培养，待细胞生长至汇合度70-90％，用含EDTA的胰蛋白酶消化并计数，取100个细胞稀释至20ml细胞培养液中，混匀，接种于96孔板，每孔200μl，置37℃细胞培养箱中培养，待细胞长至40-60％汇合度，消化后转移至24孔板中继续培养，每一株单克隆化细胞转移至一孔，待长至85-95％汇合度后消化、转移至两个24孔中继续培养，待长至85-95％汇合度将细胞进行冻存；

(2)病毒高适应性细胞单克隆株的筛选

取单克隆细胞接种至24孔板，培养过夜，吸弃培养液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及TPCK-Trypsin，37℃培养48-90h后测定细胞培养上清中的血凝滴度，血凝滴度大于2⁸为病毒高适应性细胞单克隆株；

(3)优化病毒培养条件

取病毒高适应性细胞单克隆株铺至24孔板中，培养过夜，分别优化病毒培养的温度、收获时间、添加TPCK-Trypsin的量和感染指数MOI，获得病毒在病毒高适应性细胞单克隆株中最佳生长参数；

(4)在生物反应器中培养病毒高适应性细胞单克隆株，培养48-90h后收集培养液，收集的培养液经超滤膜包浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化、超离脱糖、灭活，测定血凝素含量后配制成单价或多价流感疫苗。

2.根据权利要求1所述一种流感病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为狗肾细胞MDCK、非洲绿猴肾细胞Vero、PER.C6细胞或人二倍体细胞。

3.根据权利要求1所述一种流感病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。

4.根据权利要求1所述一种流感病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述生物反应器培养病毒高适应性细胞单克隆株的方式为微载体悬浮培养或无载体悬浮培养。

5.根据权利要求4所述一种流感病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述微载体悬浮培养中的微载体为葡聚糖微载体，用量为10-20g/L。