[发明专利]共转染药物代谢酶和转运体的细胞模型的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDR1细胞模型的构建及用途。

背景技术

口服给药是临床上最为常用的给药方式之一。口服后药物通常在小肠部位被吸收，透过小肠壁进入人体血液循环，到达靶部位而发挥疗效。小肠是药物吸收进入血液这一过程中主要的生理屏障。新药研发中，候选化合物在小肠中的透过性可影响口服药物的生物利用度，是决定化合物能否成为新药的关键因素之一。

目前广泛应用的肠道模型为Caco-2细胞(人结肠癌上皮细胞)，但Caco-2细胞并不能完全模拟人体肠道模型，因为它不能产生粘液且只表达极少量的细胞色素P450酶(CYP450)。Crespi等用含有人CYP3A4基因的P220.2载体转染Caco-2细胞，而使其CYP3A4的表达量比未转染的细胞高100倍。但该细胞系中CYP3A4的活性会在传代过程中以3-4周为半衰期而丢失。Cynthia Brimer等以pcDNA3.1和pRep10为载体将CYP3A4基因转入LLC-PK1细胞(猪肾上皮细胞)以获得高表达CYP3A4的细胞系。但LLC-PK1细胞作为肠道体外模型也存在一些缺陷和不足，缺少肠道上重要的转运蛋白。

膜转运蛋白对药物的吸收、排泄甚至是代谢，都起着至关重要的作用。它可以保护细胞免受外来毒性物质侵害。1968年，Kessell等首次报导小鼠白血病细胞系中具有多药耐药(MDR)现象。Bielder和Reiehm在1970年就首次提出MDR的概念。1976年，Juliano和Ling在中国仓鼠卵巢细胞突变体细胞膜上发现了一种与MDR有关的糖蛋白，即P-gp(P-glycoprotein，P-糖蛋白)，Genbank编号为NM_000927。P-gp是一种跨膜糖蛋白，由mdr基因编码，属于ABC转运蛋白超家族，是具有1280个氨基酸，相对分子量170kDa的膜蛋白。P-gp的二级结构包括12个穿越细胞膜区，2个ATP结合/利用位点。它分为两部分，每一部分均包括6个跨膜螺旋折叠组成的疏水区和一个ATP结合/利用位点的亲水区。Aller等人在2009年首次P-gp的晶体结构，为转运蛋白的研究跨进很大一步。在人体中，有外排作用的P-gp由MDR1基因编码。P-gp分布广泛，一般位于小肠、肝细胞、结肠和胆小管等组织的柱上皮细胞，肾脏近端小管的刷状缘，脑部的毛细管内皮细胞。这种极化的定位，有利于它发挥作用，抑制外源物吸收、帮助其消除或者保护敏感组织(如脑或胎儿)与外源物的接触。小肠上存在的多种药物外排蛋白其中最为主要的一种即P-gp。

人细胞色素P450(CYP)是广泛存在于生物体中的一类蛋白超家族，是一种含有铁卟啉辅基的b族细胞色素。CYP450细胞色素超家族中根据同源性不同被划分为多个家族和亚族，其中CYP1A2，2B6，2C9，2D6，和3A4被认为对于大部分药物的代谢相较于其他I相氧化酶贡献最多。人CYP3A家族包括CYP3A4，3A5，3A7，和3A43，其中CYP3A4在肝脏(～40％)和肠道中含量最高，代谢超过50％的临床使用药物。它参与了大多数药物的代谢并导致其首过作用，从而使药物的生物利用度降低，其中CYP3A4为其主要的亚型。。人类的CYP3A4基因位于第7号染色体q22.1，包括13个外显子及12个内含子，cDNA长度为1512个碱基，Genbank编号为NM017460。CYP3A4的晶体结构已于2004年得到解析，现在已经得到了CYP3A4单独和与药物结合的多种晶体结构(蛋白数据库：1WOE)。