[发明专利]共转染药物代谢酶和转运体的细胞模型的构建及应用无效
| 申请号： | 201210006590.X | 申请日： | 2012-01-10 |
| 公开（公告）号： | CN102586191A | 公开（公告）日： | 2012-07-18 |
| 发明（设计）人： | 曾苏;刘瑶;胡海红;余露山;蒋惠娣;周慧;徐思云;王鹭;何新 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 张法高;赵杭丽 |
| 地址： | 310027 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 转染 药物 代谢 转运 细胞 模型 构建 应用 | ||
1.一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDR1细胞模型，通过以下构建步骤实现：
（1）将MDCK细胞以105／孔种于六孔板，培养48小时，用LipofectamineTM 2000试剂将表达载体pcDNA3.1(+)／MDRl转染MDCK细胞，方法参照转染试剂说明书，转染24小时后换液，并加G418进行筛选，以浓度600ug／mL筛选96小时后升至800ug／mL筛选24小时；
（2）将存活的细胞转移至培养瓶内培养，以600ug／mL的浓度培养二十天左右，按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆，通过在mRNA，蛋白等水平检测，筛选出活性较高的MDCK-MDRl细胞；
（3）将MDCK-MDR1细胞以相同的密度种植于6孔板中，当细胞达50-70%汇合时进行转染，使用Lipofectamine? LTX转染试剂将表达载体pcDNA3.1(+)/Hygro/CYP3A4转染至MDCK-MDR1细胞，方法参照转染试剂说明书，转染6小时后换含10%FBS的DMEM培养基，培养24小时后将培养基换成400 ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培养基；
（5）隔一天换新鲜的含400 ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培养基，筛选14天左右将存活的细胞按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆MDCK-MDRl/CYP3A4细胞，由中国典型培养物保藏中心保藏；地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期：2011年12月15日；培养物名称：犬肾细胞MDCK-MDR1/CYP3A4，保藏编号为：CCTCC C2011119。
2.根据权利要求1所述的一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDR1细胞模型，其特征在于，步骤（2）中，在mRNA水平验证MDR1基因转录水平，采用的引物序列分别为
。
3.根据权利要求1所述的一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDR1细胞模型，其特征在于，步骤（3）中，构建表达载体pcDNA3.1(+)/Hygro/CYP3A4中CYP3A4的引物序列为5’-CGGGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC-3’ ； 5’-ATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTGC-3’。
4. 根据权利要求1所述的一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDR1细胞模型在P-gp和CYP3A4共同底物筛选中的应用。
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