[发明专利]蛋白A的新型耐碱变体及其在亲和色谱中的用途无效
申请号: | 201180061195.5 | 申请日: | 2011-12-21 |
公开(公告)号: | CN103403020A | 公开(公告)日: | 2013-11-20 |
发明(设计)人: | 李顺成;李星;考特尼·沃斯;中村聪;福田哲夫;冈野友亮;盐谷知范;田守功二 | 申请(专利权)人: | JSR株式会社;西安大略大学 |
主分类号: | C07K14/31 | 分类号: | C07K14/31;C07K1/22;C07K16/00;C07K17/00 |
代理公司: | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人: | 彭鲲鹏;卢蓓 |
地址: | 日本*** | 国省代码: | 日本;JP |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 蛋白 新型 变体 及其 亲和 色谱 中的 用途 | ||
技术领域
本发明涉及几种具有耐碱特性的免疫球蛋白(Ig)配体蛋白质,其在固体支持物上的固定,以及所得亲和基质在Ig纯化中的应用。
发明背景
蛋白A是由细菌(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))编码的膜蛋白。蛋白A由排列为E-D-A-B-C的五个同源结构域组成。蛋白A的独特之处在于其能够结合来自多个物种(包括人)的大多数抗体(包括IgG、IgM、IgE、IgA)。因此,蛋白A已被广泛用作固定于固体支持物(例如树脂)上的蛋白质配体以形成用于抗体纯化的亲和柱,从而用于研究和治疗应用。
为了深入探索蛋白A用于药物和生物技术应用二者的抗体结合特性,已在研究提高蛋白A在固体树脂上固定化效率的方法以及提高固定化后蛋白A稳定性并减少其渗漏的方法。对此,美国专利No.5,084,559和5,260,373描述了固定蛋白A的的方法,其中将单个半胱氨酸残基或单个精氨酸残基添加到蛋白A的N端或者其一个结构域或多个结构域的N端,以利于其固定。美国专利No.7,485,704(其中通过降低抗体纯化期间的温度使蛋白A配体渗漏减少)和美国专利(US 7,709,209)(其中通过使蛋白A结构域序列中的特定天冬酰胺残基突变为除谷氨酰胺或天冬氨酸之外的氨基酸而提高所述结构域的碱稳定性)中还描述了使固定化蛋白质稳定的方法。
尽管如此,仍需要开发用于蛋白质固定和增强配体稳定性的改进方法。
亲和色谱是最有用的分离方法之一,其在单一步骤中以高回收率纯化蛋白质。基于环氧基的偶联是肽或蛋白质固定中广泛使用的技术。环氧基包含氧原子,所述氧原子通过单键与两个相邻碳原子连接以形成环氧环。该官能团能够与蛋白质表面上的不同亲核基团反应以形成强连接,其具有最小的化学修饰。但是,环氧树脂上的固定效率在很大程度上取决于给定肽或蛋白质的组成(包括氨基酸序列、pI和蛋白质二级结构)和反应条件(包括pH、偶联缓冲液组成和盐浓度)。
发明内容
在一个实施方案中,本发明提供了免疫球蛋白(Ig)结合蛋白的变体,所述变体包含所述Ig结合蛋白中至少一个天冬酰胺(Asn)残基被替换为组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)和苏氨酸(Thr)残基的Ig结合蛋白,其中所述至少一个替换使得当与所述Ig结合蛋白相比时所述变体具有提高的碱稳定性。
在一个实施方案中,本发明提供了用于亲和分离的基质,其特征在于所述基质包含与固体支持物偶联的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白之变体,所述变体包含所述Ig结合蛋白中至少一个Asn残基被替换为His、Ser、Asp和Thr残基的Ig结合蛋白,所述至少一个替换使得当与所述Ig结合蛋白相比时所述变体具有提高的碱稳定性。
在一个实施方案中,本发明提供了从组合物中分离免疫球蛋白(Ig)的方法,所述组合物包含Ig和待与所述Ig分离的至少一种其他物质,所述方法的特征在于所述方法包括使所述组合物与用于亲和分离的基质相接触,所述基质包含与固体支持物偶联的Ig结合蛋白之变体,从而将Ig与组合物中的至少一种其他物质相分离,所述变体包含所述Ig结合蛋白中至少一个Asn残基被替换为His、Ser、Asp和Thr残基的Ig结合蛋白,所述至少一个替换使得当与所述Ig结合蛋白相比时所述变体具有提高的碱稳定性。
在本发明的一个实施方案中,所述变体Ig结合蛋白是蛋白A。
在本发明的另一个实施方案中,所述Ig结合蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中,所述变体Ig结合蛋白包含这样的Ig结合蛋白:其包含具有Asn3His(SEQ ID NO:1第3位的天冬酰胺残基被替换为组氨酸残基)替换或Asn3Ser替换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中,所述变体Ig结合蛋白包含这样的Ig结合蛋白:其包含具有Asn6Asp替换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中,所述变体Ig结合蛋白包含这样的Ig结合蛋白:其包含具有Asn23Ser替换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中,所述变体Ig结合蛋白包含这样的Ig结合蛋白:其包含具有选自Asn3His/Asn23Ser或Asn3His/An23Thr的双替换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
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- 2014-08-28 - 2016-04-06 - C07K14/31
- 本公开内容涉及一类工程化多肽,并提供了包含序列EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29X30PX32QSX35X36LLX39EAKKX45X46X47Q的多肽。本公开内容还涉及基于共同支架的多肽变体的群体,所述群体中的每个多肽包含氨基酸序列EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29X30PX32QSX35X36LLX39EAKKLX45X46X47Q;并涉及用于从所述群体选择具有对预定靶的亲和力的期望的多肽的方法。
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