[发明专利]一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种三角帆蚌幼蚌DNA的取样方法。

背景技术

三角帆蚌是中国特有的淡水育珠母蚌，选育出品质优良的三角帆蚌是当前需要解决的关键问题之一。利用分子生物学手段(如分子标记技术等)能有效对三角帆蚌进行遗传育种和种质改良。

提取一定质量的高浓度基因组DNA是进行分子生物学研究的基础和前提，成体三角帆蚌活体提取DNA比较简便，但小规格三角帆蚌幼蚌活体提取DNA操作非常困难，目前均采用处死幼蚌，收集组织，进而提取DNA的方式，但这样会导致大量含有足够遗传信息的优良个体损失，所获得的个体遗传信息在选种上来说已经没有实际意义。因此，亟待建立一种提取三角帆蚌幼蚌活体DNA的方法。

三角帆蚌繁殖存在一雌多雄受精的现象，在对亲本的遗传背景缺乏了解的情况下，可以利用幼蚌活体提取DNA技术鉴定幼蚌的遗传多态性及个体间的亲缘关系，进而选留优良个体单独培育，可以节省大量财力物力；利用幼蚌活体提取DNA技术可以进行目标经济性状的早期预选、基因筛选、养殖状况监测等多项研究工作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术中的不足，提供一种获取三角帆蚌幼蚌活体微量组织提取DNA的方法。

为了解决上述问题本发明的技术方案是这样的：

一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，包括以下步骤：

1)幼蚌外套膜组织的剥离：

选取脱苗后50天的幼蚌20只，分成实验组和对照组，每组各10只，对幼蚌进行标记，并记录每只幼蚌的体长和体重；用刀片轻轻撬开实验组幼蚌蚌壳2～3mm，沿边缘划取外套膜组织，取样2mg，用镊子夹取至离心管中；

2)剥离组织基因组DNA的提取：

a.在上述离心管中加入200μl裂解液，55℃水浴消化至澄清，轻轻摇匀数次；

b.之后加入200μl苯酚，轻微翻转混合10min后，12000r/min离心20min，用前端剪掉1cm的粗口枪头吸取上清液至新的离心管；

c.重复步骤b，之后加入200μl苯酚-氯仿-异丙醇混合液，其中苯酚、氯仿和异丙醇的体积比为25∶24∶1，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；

d.之后加入200μl氯仿-异丙醇混合液，其中氯仿和异丙醇的体积比为24∶1，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；

e.之后加入两倍于离心管中溶液体积的无水乙醇，其中无水乙醇的温度为-20℃，然后于-20℃冰箱中静置至少30min，12000r/min离心20min，倒掉溶液；

f.在离心管中加入70％乙醇200μl，洗涤两次，之后倒掉离心管中的液体，室温晾干；

g.待酒精挥发完全后，加入80μl无菌水，4℃冰箱中溶解至少4小时；

3)提取DNA的检测：

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，DNA大分子条带清晰明亮；分光光度计检测DNA的浓度和纯度，DNA的浓度在42～130ng/μl，DNA含量在3360ng以上，OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8以上；

4)幼蚌培育：

将取样后的幼蚌放入1L浓度为0.01mg/L的金霉素消毒液中，浸泡30分钟后与对照组幼蚌均匀洒在底部铺有2cm细泥沙的培育池中，将富含浮游生物的水注入培育池中对幼蚌进行流水培育，并保持水流平稳以减少刺激，直至幼蚌达到稳定生长状态，一个月后，对实验组和对照组幼蚌生长数据进行T检验和SNK检验，结果均显示实验组和对照组幼蚌的生长无显著差异。

步骤1)中所述幼蚌的体长为1.7～2.1cm，体重243～391mg。

步骤a中所述裂解液的成分如下：

1mol/L Tris-HCL                              10μl，

0.5mol/L EDTA                                40μl，

10％SDS                                      20μl，

10mg/ml Proteinase K                         2μl。

所述1mol/L Tris-HCL的pH为8.0。

步骤2)中抽提DNA时均采用粗口枪头。