[发明专利]一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法

权利要求书

1.一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)幼蚌外套膜组织的剥离：

选取脱苗后50天的幼蚌20只，分成实验组和对照组，每组各10只，对幼蚌进行标记，并记录每只幼蚌的体长和体重；用刀片轻轻撬开实验组幼蚌蚌壳2～3mm，沿边缘划取外套膜组织，取样2mg，用镊子夹取至离心管中；

2)剥离组织基因组DNA的提取：

a.在上述离心管中加入200μl裂解液，55℃水浴消化至澄清，轻轻摇匀数次；

b.之后加入200μl苯酚，轻微翻转混合10min后，12000r/min离心20min，用前端剪掉1cm的粗口枪头吸取上清液至新的离心管；

c.重复步骤b，之后加入200μl苯酚-氯仿-异丙醇混合液，其中苯酚、氯仿和异丙醇的体积比为25∶24∶1，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；

d.之后加入200μl氯仿-异丙醇混合液，其中氯仿和异丙醇的体积比为24∶1，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；

e.之后加入两倍于离心管中溶液体积的无水乙醇，其中无水乙醇的温度为-20℃，然后于-20℃冰箱中静置至少30min，12000r/min离心20min，倒掉溶液；

f.在离心管中加入70％乙醇200μl，洗涤两次，之后倒掉离心管中的液体，室温晾干；

g.待酒精挥发完全后，加入80μl无菌水，4℃冰箱中溶解至少4小时；

3)提取DNA的检测：

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，DNA大分子条带清晰明亮；分光光度计检测DNA的浓度和纯度，DNA的浓度在42～130ng/μl，DNA含量在3360ng以上，OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8以上；

4)幼蚌培育：

将取样后的幼蚌放入1L浓度为0.01mg/L的金霉素消毒液中，浸泡30分钟后与对照组幼蚌均匀洒在底部铺有2cm细泥沙的培育池中，将富含浮游生物的水注入培育池中对幼蚌进行流水培育，并保持水流平稳以减少刺激，直至幼蚌达到稳定生长状态，一个月后，对实验组和对照组幼蚌生长数据进行T检验和SNK检验，结果均显示实验组和对照组幼蚌的生长无显著差异。

2.根据权利要求1所述的一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，其特征在于，步骤1)中所述幼蚌的体长为1.7～2.1cm，体重为243～391mg。

3.根据权利要求1所述的一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，其特征在于，步骤a中所述裂解液的成分如下：

1mol/L Tris-HCL                                    10μl，

0.5mol/L EDTA                                      40μl，

10％SDS                                            20μl，

10mg/ml Proteinase K                               2μl。

4.根据权利要求3所述的一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，其特征在于，所述1mol/L Tris-HCL的pH为8.0。

5.根据权利要求1所述的一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，其特征在于，步骤2)中抽提DNA时均采用粗口枪头。