[发明专利]含有保护赖氨酸的胰岛素原及使用其制备胰岛素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组胰岛素领域。更具体而言，本发明涉及带有保护氨基酸的胰岛素及其制备方法和用途。

背景技术

胰岛素，特别是重组胰岛素例如人重组胰岛素，在医药领域有广泛的应用。目前，有两种路线用于生产重组人胰岛素-“连锁组合”路线和“胰岛素原”路线。在“连锁组合”路线中，通过生物重组分别合成组成人胰岛素的两条肽链-A链和B链，然后再将A链和B链混合，产生二硫键生成具有生物活性的人胰岛素。然而，在该路线中，通过直接混合两条肽链来产生具有生物活性的人胰岛素的效率相对比较低。“胰岛素原”路线现在更为常用，在该路线中，首先在表达载体例如大肠杆菌或者酵母中表达由人胰岛素A链、B链和C链组成的人胰岛素原，将其纯化后在体外进行复性。将复性后的人胰岛素原用胰蛋白酶和羧肽酶B水解，得到具有天然活性的人胰岛素。在该路线中，会产生消去B链30位苏氨酸的胰岛素副产物(DesB30-胰岛素)，该副产物对胰岛素质量有不利影响。为了减少DesB30-胰岛素的产生，必须严格控制胰蛋白酶的用量、pH值和反应时间，使反应条件得难以控制。尽管进行了许多努力，还是不能完全避免DesB30-胰岛素，因为DesB30-胰岛素和胰岛素之间仅相差一个苏氨酸，将它们进行分离非常之困难。现在，普遍使用大型高效液相色谱分离胰岛素和DesB30-胰岛素，该分离过程大大加大了重组人胰岛素的生产成本，而且会产生大量的工业废物。

现有技术中需要一种通过表达胰岛素原制备胰岛素的方法，避免胰蛋白酶对胰岛素原水解后消去B链30位苏氨酸。

发明内容

本发明人经过大量实验发现，用保护赖氨酸代替胰岛素原中第29位(对应于胰岛素B链29位(B29))上的赖氨酸，得到的带有保护赖氨酸的胰岛素原在被胰蛋白酶和羧肽酶B水解时不会产生消去B链30位苏氨酸的胰岛素，这样的胰岛素原经复性、酶解处理后，得到的在B29带有保护赖氨酸的胰岛素，根据不同的保护基团，在相应的条件下去保护，保护赖氨酸可转化为赖氨酸，形成具有活性的胰岛素。

因此，在第一方面，本发明提供了一种第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原。

在一个实施方案中，本发明还提供了一种在B29带有保护赖氨酸的胰岛素。

因此，本发明的带有保护赖氨酸的胰岛素或胰岛素原比未经修饰的胰岛素或胰岛素原更稳定。

为了通过生物翻译体系合成在B29带有保护赖氨酸的胰岛素或者在第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原，本发明还提供了编码上述带有保护赖氨酸的胰岛素或胰岛素原的基因。对于人胰岛素原而言，所述编码带有保护赖氨酸的人胰岛素原的基因的序列为SEQ ID NO.5。

因此，在第二方面中，本发明提供了一种编码在第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原的基因，所述基因是编码胰岛素原的基因，其中编码第29位氨基酸的密码子是UAG。

在一个实施方案中，本发明还提供了一种编码在B29带有保护赖氨酸的胰岛素的基因，所述基因是编码胰岛素的基因，其中编码B29的氨基酸的密码子是UAG。

在第三方面中，本发明还提供了一种制备在第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原的方法，包括

在存在保护赖氨酰-tRNA_CUA的情况下，使在编码第29位氨基酸残基的密码子为UAG的胰岛素原基因mRNA在合适的翻译体系中翻译。

在一个实施方案中，本发明还提供了一种制备在第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原的方法，包括

在存在吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶、tRNA_CUA的情况下，在加有保护赖氨酸的培养基中，使在编码第29位氨基酸残基的密码子为UAG的胰岛素原基因在细胞的翻译体系中翻译。

在一个具体实施方案中，本发明还提供了一种制备在第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原的方法，包括

在存在编码吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶基因和保护赖氨酸、tRNA_CUA基因，使在编码第29位氨基酸残基的密码子为UAG的胰岛素原基因在翻译体系中翻译。

在一些实施方案中，本发明还提供了一种制备胰岛素的方法，包括

(1)将根据本发明的方法制备的在第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原复性，使所述复性后的修饰胰岛素原水解成B29带有保护赖氨酸的胰岛素；

(2)使步骤(1)中得到的带有保护赖氨酸的胰岛素上的保护赖氨酸转化为赖氨酸，得到胰岛素。