[发明专利]含有保护赖氨酸的胰岛素原及使用其制备胰岛素的方法

权利要求书

1.第29位带有保护赖氨酸的胰岛素原。

2.根据权利要求1的胰岛素原，所述胰岛素原是重组人胰岛素原、天然人胰岛素原、赖脯胰岛素原、地特胰岛素原、门东胰岛素原或甘精胰岛素原。

3.根据权利要求1的胰岛素原，所述保护赖氨酸是侧链氨基的一个氢原子被保护性化学官能团取代的赖氨酸。

4.根据权利要求1或3的胰岛素原，所述保护赖氨酸是Nε-(叔丁氧碳基)-赖氨酸、Nε-(苄氧碳基)-赖氨酸、Nε-(邻硝基苄氧碳基)-赖氨酸、Nε-(对硝基苄氧碳基)-赖氨酸、Nε-(烯丙氧碳基)-赖氨酸、Nε-(炔丙氧碳基)-赖氨酸、Nε-(脯氨酰基)-赖氨酸、Nε-(半胱氨酰基)-赖氨酸、Nε-(环戊基氧碳基)-赖氨酸或Nε-((1-(6-硝基苯甲酸[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)乙氧基)羰基)-赖氨酸。

5.编码权利要求1的胰岛素原的胰岛素原基因，所述胰岛素原基因在编码第29位氨基酸残基的密码子是终止子，所述终止子是琥珀密码子UAG、赭石密码子UAA和蛋白石密码子UGA。

6.权利要求5的胰岛素原基因，所述胰岛素原基因序列是SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。

7.B链第29位带有保护赖氨酸的胰岛素。

8.根据权利要求7的胰岛素，所述胰岛素是重组人胰岛素、天然人胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、门东胰岛素或甘精胰岛素。

9.根据权利要求7的胰岛素，所述保护赖氨酸是侧链氨基的一个氢原子被保护性化学官能团取代的赖氨酸。

10.根据权利要求7或9的胰岛素，所述保护赖氨酸是Nε-(叔丁氧碳基)-赖氨酸、Nε-(苄氧碳基)-赖氨酸、Nε-(邻硝基苄氧碳基)-赖氨酸、Nε-(对硝基苄氧碳基)-赖氨酸、Nε-(烯丙氧碳基)-赖氨酸、Nε-(炔丙氧碳基)-赖氨酸、Nε-(脯氨酰基)-赖氨酸、Nε-(半胱氨酰基)-赖氨酸、Nε-(环戊基氧碳基)-赖氨酸或Nε-((1-(6-硝基苯甲酸[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)乙氧基)羰基)-赖氨酸。

11.编码权利要求7的胰岛素的基因，所述基因在编码B链第29位氨基酸残基的密码子是终止子，所述终止子是琥珀密码子UAG、赭石密码子UAA和蛋白石密码子UGA。

12.一种制备权利要求1的胰岛素原的方法，包括

在存在保护赖氨酰-tRNA的情况下，使在编码第29位氨基酸残基的密码子为终止子的胰岛素原基因mRNA在合适的翻译体系中翻译，其中所述tRNA是tRNA_CUA时所述终止子是琥珀密码子UAG，所述tRNA是tRNA_UUA时所述终止子是赭石密码子UAA，所述tRNA是tRNA_UCA时所述终止子是蛋白石密码子UGA。

13.一种制备权利要求1的胰岛素原的方法，包括

在存在吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶、吡咯赖氨酸tRNA的情况下，在加有保护赖氨酸的培养基中，使在编码第29位氨基酸残基的密码子为终止子的胰岛素原基因在细胞的翻译体系中翻译，其中所述吡咯赖氨酸tRNA是tRNA_CUA时所述终止子是琥珀密码子UAG，所述吡咯赖氨酸tRNA是tRNA_UUA时所述终止子是赭石密码子UAA，所述吡咯赖氨酸tRNA是tRNA_UCA时所述终止子是蛋白石密码子UGA。

14.一种制备权利要求1的胰岛素原的方法，包括

在存在编码吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶基因和保护赖氨酸、吡咯赖氨酸tRNA基因，使在编码第29位氨基酸残基的密码子为终止子的胰岛素原基因在翻译体系中翻译，其中所述吡咯赖氨酸tRNA是tRNA_CUA时所述终止子是琥珀密码子UAG，所述吡咯赖氨酸tRNA是tRNA_UUA时所述终止子是赭石密码子UAA，所述吡咯赖氨酸tRNA是tRNA_UCA时所述终止子是蛋白石密码子UGA。