[发明专利]提高水稻分蘖的小分子RNA Osa-miR393及用途

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻分蘖的小分子microRNAOsa-miR393及其作用的靶基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460，同时涉及该microRNA和靶基因在转基因水稻中的应用。本发明利用网上microRNA数据库克隆了一种属于bHLB转录因子的小分子RNA Osa-miR393，将其导入pNW55载体后，通过酶切连入双元表达载体pCambial301，构建超量表达载体Ami393，并转入水稻中花11。该microRNA超表达后的T0、T1和T2代转基因植株均稳定出现分蘖数目显著性增加的现象。该基因及其与靶基因作用的模式对于阐述小分子RNA调控水稻的生长发育过程，控制植株分蘖及抗性能力方面具有重要的应用价值。 

背景技术

水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人以其为主食。为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍然是人们面临的巨大挑战。在产量构成因素穗数、穗粒数和粒重中，穗数的多少在很大程度上受制于分蘖的发生量，因而分蘖是影响水稻与小麦等主要农作物单产的重要农艺形状之一。同时，分蘖又是单子叶植物一种特殊的分枝现象，具有重要的发育生物学意义。探索控制水稻分蘖的分子机理将有助于生产上遗传调控分蘖并促进植物分枝的分子机理研究，而水稻中与分蘖相关基因的分离与鉴定是控制水稻分蘖的分子机理研究的瓶颈。一些参与调控水稻分蘖的重要基因与拟南芥都属于同源基因。如水稻MONOCULM1(MOC1)和Arabidopsis LATERAL SUPPRESSOR(LAS)是同源基因，分别在控制水稻和拟南芥花芽的分化方面具有重要意义。(Li X，Qian Q，Fu Z，et al.Control of tilleringin rice.Nature，2003，422：618-621.Greb T，Clarenz O，Schafer E，et al.Molecular analysis of theLATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillarymeristem formation.Genes Dev，2003，17：1175-1187.)已经得到了很多控制水稻和拟南芥分蘖的突变体，分别命名为more axillary growth(max)and dwarf(d)Mutants。这些突变体具有类似的表型：分蘖增加和植株变矮。这些突变体性状的形成都是由于独脚金萌发素内酯(strigolactone)的合成或者信号传导受限所导致的(Umehara M，Hanada A，Yoshida S，et al.Inhibition of shoot branching by new terpenoid planthormones.Nature，2008，455：195-200；Gomez-Roldan V，Fermas S，Brewer PB，et al.Strigolactone inhibition of shoot branching.Nature， 2008，455：189-194.)。至目前为止，已经克隆出多个与水稻分蘖相关的基因，1个就是我国李学勇等研究的MOC1基因(Fengli Sun，Weiping Zhang，Guosheng Xiong，Meixian Yan，QianQian，Jiayang Li，Yonghong Wang.Identification and functional analysis of the MOC1 interactingprotein 1 J.Genet.Genomics，2010，37：69-77.)。另两个则都是日本人研究的OsTB1基因和D3基因(Takeda T，Suwa Y，et al.The OsTB1 gene negatively regulates lateral branching in rice.Plant J，2003，33(3)：513-20.；Haifang Yan，Hiroaki Saika，et al.Rice tillering dwarf mutant dwarf3has increased leaf longevity during darkness-induced senescence or hydrogen peroxide-induced celldeath.Genes genetic systems，2007，82(4)：361-366)。MOC1基因是李家洋院士等以自然发生的一个单秆分蘖的突变体“moc1”为材料，采用图位克隆的方法分离出来的控制水稻分蘖的关键基因。MOC1基因控制着腋生分生组织的起始和分蘖芽的形成，同时还有促进分蘖芽生长的功能。水稻OsTB1基因，是Takeda等基于与玉米TB1(Teosinte branched 1)基因序列相似性采用同源克隆方法分离出来的。基因功能研究发现，OsTB1基因控制侧芽伸长。OsTB1的过量表达抑制侧芽的生长，过量表达的转基因水稻植株分蘖数目显著减少，而侧芽的起始不受影响。水稻中一个典型的突变体“fc1”(fine culm1)被发现缺失OsTB1功能，其表现为分蘖增多。D3基因是Ishikawa等最近以多蘖型矮秆突变体“Id3”为材料，采用图位克隆的方法分离出来的与水稻分蘖相关的又一新基因(Ishikawa S，Maekawa M，Arite T，et al.Suppression oftiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice.Plant Cell Physiol，2005，46：79-86.)。张等研究发现Osa-MIR156e在水稻中的表达量高低影响了水稻的分蘖数。水稻的分蘖是一个复杂的发育性状，易受环境影响，故通常也被认为受数量性状位点(QTLs)控制。这方面的研究报道很多，至今至少已发现了27个影响分蘖数目的数量性状位点，分布在除第9染色体之外的其余11条染色体上，但不同研究者的结果很不一致，不仅QTL数目、在染色体上分布不一致，而且QTL的贡献率、效应也不同。目前对QTL的分析在相当程度上还是建立在统计分析的基础上，缺乏十分完善的分析方法及应用软件来分析基因之间的互作，从而难以精细定位单个QTL以及分析其效应和互作方式，进而进行位点克隆或获取目标QTL基因。控制分蘖数目的QTL也不例外，至目前为止还没有通过图位克隆的方法分离相关的QTL的报道，更未进行基因功能与表达调控分析。因此，现在各国都在创建各种突变体库，并以此为平台克隆基因，而更多的植物分蘖基因也有望通过此方法被克隆出来。