[发明专利]一种小核酸的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种小核酸的检测方法及其应用，尤其是指一种双链小核酸的检测方法及其应用。

背景技术

RNA干扰（RNA interference，RNAi），是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。

随着RNAi研究的发展，RNAi已经成为目前基因功能研究，药靶发现以及药物开发的基础，RNAi药物将有望成为的一种更为高效快捷的疾病治疗途径，小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）作为RNAi的效应分子，其作为治疗药物的具有越来越广阔的前景。截至目前，已经有多种siRNA药物进入临床实验，预示着在不久的将来，将会出现商业化的siRNA药物，为攻克人类的各种疾病作出贡献。随着siRNA药物研究的发展，急需一种可以精确定量检测siRNA的技术，来帮助人们了解siRNA在体内的传递和药物代谢动力学特征。

因为siRNA序列比较短小，一般只有19~23bp；作为药物使用的siRNA，均是通过化学合成，且合成的siRNA带有的3’突出端；在siRNA药物开发过程中，为了提高siRNA的稳定性和穿透细胞的能力，会对其化学结构做不同修饰。目前还没有一种简便、快捷、精确的方法来进行siRNA的定量分析。之前的研究报道了多种定量方法，如包括Elsia分析（Kim EJ等，J Control Release， 2010，143(1):80-7.），放射标记杂交分析（Jin J等，Biotechniques. 2010 Jun; 48(6): xvii-xxiii.）等，这些方法耗时，成本昂贵，检测范围窄，检测限高等缺点。各种基于miRNA（一种短小的单链RNA）的PCR的方法，如末端加尾，磷酸接头连接，Stem-Loop PCR的方法（Chen C等，Nucleic Acids Res. 2005;33(20):e179.），因合成的siRNA与内源性siRNA结构的差异，均不能很好的解决siRNA的精确定量。

通常，我们把siRNA，miRNA及其它非编小RNA称之为小核酸。

锁核酸（locked nucleic acid，LNA）（Nielsen CB等，J Biomol Struct Dyn，1999；17(2)：175-91）是一种人工合成的反义寡核苷酸，其中核苷酸残基的核糖环的2’-氧和4’-碳通过亚甲基连接。其与靶核酸分子具有强的杂交能力，不易被酶降解，应用于抑制靶核酸功能的研究中。利用这类核酸可以增加引子或探针（probe）的熔解温度（Tm值），提高杂交产物的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测效率高、特异性强及敏感度高的双链小核酸的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种双链小核酸的检测方法，其特征在于，包括设计与小核酸的一条链互补的封闭核酸和与小核酸另一条链3’端互补的反转录茎环引物以及用于定量PCR的正向引物和反向引物，制备小核酸待检测样品，通过变性、封闭、反转录和定量PCR的方法来检测小核酸。

所述的变性的具体步骤为：将小核酸高温加热使双链解开成单链。所述的封闭的具体步骤为：使用几条封闭核酸竞争性杂交小核酸其中一条链。所述的反转录的具体步骤为：用针对小核酸另一条链的反转录茎环引物反转录合成cDNA。所述的定量PCR的方法的具体步骤为：制备小核酸标准样品，用正向引物和反向引物定量PCR扩增待检测样品和标准样品，分析实验数据绘制标准曲线。

其中，所述的小核酸待检测样品的制备可以包括小核酸的纯化、提取、分离等，具体可以是从全血中分离血清样品，从组织中用RNA提纯试剂提纯总RNA样品。

所述的小核酸包括siRNA和miRNA模拟物（miRNA mimics，一种具有miRNA活性的双链miRNA模拟物），及其它双链结构的短链RNA。

在一个优选的实施方式中，上述双链小核酸是siRNA。

所述的封闭核酸的设计方法为：从小核酸一条链的3’端第一个碱基开始连续或间隔选取5~7个核苷酸（nucleotide，nt）长度的核苷酸。

所述的封闭核酸可以是RNA或DNA分子，或是含有修饰（如甲氧基修饰，或LNA修饰等）的RNA或DNA分子。

所述的反转录茎环引物的3’端的6~8个碱基与靶序列的3’端序列互补。