[发明专利]小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及动物干细胞的分离方法，尤其涉及一种小鼠脂肪干细胞分离、培养及纯化的方法。

[背景技术]

脂肪干细胞具有多向分化的潜能，在体外可定向分化为脂肪、成骨、软骨、肝脏、心肌细胞等，在人源方面，相比于骨髓干细胞，其具有取材容易、获取量大、减少供体取材时痛苦的优点，因此在再生医学上具有重要的意义。小鼠作为一个重要的模式动物，在基础研究方面有着广泛的应用，但是小鼠脂肪干细胞的体外培养却一直是个难题，涉及所用的消化液、培养液等各个方面，以及所采取的分离方法与培养方法。对于现有资料的方法，纷繁芜杂，经实际操作后发现效果并不是十分的理想，其不足之处在于：可操作性不强，有需要改进的地方。为此本发明针对实践过程中出现的一些问题，在相关环节上做了一些改进，经过多次尝试，形成了一个相对较完善，可操作性强的小鼠脂肪干细胞的消化分离体系和分离后细胞的培养方法。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠脂肪干细胞分离、培养及纯化的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，包括以下步骤：

一、细胞的分离

(1)取材：取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒；

(2)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入含青霉素和链霉素的DPBS液中洗净血污；

(3)去除脂肪组织中的血管，再次洗涤，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液(10％FBS，0.09％胶原酶I，其余成分为DMEM/F12)，用连接有1ml吸嘴的移液器充分吹打，直至组织能够很通畅的出入吸嘴，将脂肪组织转入离心管中；记录加入消化液的量和最终悬液的体积，以计算脂肪组织的量，并使最终消化液的体积是脂肪组织的2-3倍；

(4)37℃消化1h，定期摇动，使组织块与消化液充分接触；

(5)消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液；

(6)低速离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打至少1min，再次离心；

(7)弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；

(8)将细胞悬液用尼龙滤网过滤，所得滤液再次过滤，除去大部分成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上细胞的残留；

(9)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；

二、细胞培养

(10)最后一次离心后用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规条件(37℃，5％CO₂，100％湿度)培养；

(11)每0.4-0.6ml的脂肪组织分离得到的细胞接种到六孔板的一孔中；

(12)首次换液：原代接种2h后加入DPBS，反复洗涤5-6次，洗去大部分杂细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；

(13)第二次换液：首次换液24h后对其进行第二次洗涤，进一步洗去未贴壁细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；

(14)第三次换液：首次换液后72h后进行第三次洗涤，直至细胞面基本干净，加入新鲜的完全培养基继续培养；后期每3天半量换液一次，长至90％满即传代；

三、纯化

(15)细胞长满后，加入胰酶消化2min，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去；利用此方法多次传代，逐渐降低杂细胞的比例，从而达到纯化的目的。

作为优选，步骤(2)所述青霉素的浓度为400IU/ml；所述链霉素的浓度为400μg/ml。

作为优选，从步骤(2)切取出脂肪组织至步骤(10)最后一次离心后用完全培养基重悬并接种，整个过程时间控制在4h以内。

作为优选，步骤(8)中，先用孔径为250μm的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μm的尼龙滤网过滤。

作为优选，完全培养基的组成成分为：胎牛血清20％，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，DMEM/F12补足到100％。

作为优选，基础培养基的组成成分为：胎牛血清20％，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，DMEM/F12补足到100％。

相比现有技术，本发明主要在以下三方面做出了改进：