[发明专利]小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法

权利要求书

1.一种小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，包括以下步骤：

一、细胞的分离

(1)取材：取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒；

(2)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入含青霉素和链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中洗净血污；

(3)去除脂肪组织中的血管，再次洗涤，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液，消化液的组成成分为10％胎牛血清(FBS)，0.09％胶原酶I，余量为DMEM/F12；用连接有1ml吸嘴的移液器充分吹打，直至组织能够很通畅的出入吸嘴，将脂肪组织转入离心管中；记录加入消化液的量和最终悬液的体积，以计算脂肪组织的量，并使最终消化液的体积是脂肪组织的2-3倍；

(4)37℃消化1h，定时摇动，使组织块与消化液充分接触；

(5)消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液；

(6)1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打至少1min，再次离心；

(7)弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；

(8)将细胞悬液先用孔径为250μm的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μm的尼龙滤网过滤，除去大部分成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上细胞的残留；

(9)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；

二、细胞培养

(10)最后一次离心后用完全培养基重悬，接种，置于培养箱常规条件培养；

(11)每0.4-0.6ml左右的脂肪组织分离得到的细胞接种到六孔板的一孔中；

(12)首次换液：原代接种2h后加入弃去培养基，用DPBS反复洗涤5-6次，洗去大部分杂细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；

(13)第二次换液：首次换液24h后对其进行第二次洗涤，进一步洗去未贴壁细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；

(14)第三次换液：首次换液后72h后进行第三次洗涤，直至细胞面基本干净，加入新鲜的完全培养基继续培养；后期每3天半量换液一次，长至90％满即传代；

三、纯化

(15)细胞长满后，加入胰酶消化2min，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去；利用此方法多次传代，逐渐降低杂细胞的比例，从而达到纯化的目的。

2.根据权利要求1所述小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述青霉素的浓度为400IU/ml；所述链霉素的浓度为400μg/ml。

3.根据权利要求1所述小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，其特征在于，从步骤(2)切取出脂肪组织至步骤(10)最后一次离心后用完全培养基重悬并接种，整个过程时间控制在4h以内。

4.根据权利要求1所述小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，其特征在于，所述步骤(8)中，先用孔径为250μm的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μm的尼龙滤网过滤。根据权利要求1所述小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，其特征在于，所述完全培养基的组成成分为：胎牛血清20％，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，DMEM/F12补足至100％。

5.根据权利要求1所述小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，其特征在于，所述基础培养基的组成成分为：胎牛血清20％，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，DMEM/F12补足至100％。