[发明专利]基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，尤其是一种基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

I群禽腺病毒(fowl adenovirus group I，FAVI)归于腺病毒科禽腺病毒属，具有共同的群抗原，基于分子结构的差异可分为5个种(FAV A-E)，基于交叉中和试验结果可分为12个血清型(FAV1-12)。该群病毒包括常规的禽腺病毒(代表株为鸡胚致死孤儿)，在世界范围内广泛存在，较多的存在于禽类体内，而不发病。虽然FAVI不是引起发病的重要病原，但可与其他病原共同作用于家禽，具有继发性。近年来，由FAVI引起的包涵体肝炎、心包积液综合征和砂囊糜烂的感染呈上升趋势，在国内外引起了广泛的关注。研究表明，该病与传染性法氏囊和传染性贫血有关。此外，该病既可经卵垂直传递污染鸡胚，也可经排泄物水平传播，这给防控该病带来了巨大的困难。

目前，采用普通PCR法检测FAVI临床样品，耗时费力，无法快速处理和诊断大量样品；利用血清学检测方法，如中和试验，由于存在交叉反应而不能确切诊断，且需在动物、鸡胚或组织培养细胞等活体内进行；琼脂凝胶免疫扩散由于沉淀素扩散需孵育2天，拖延了诊断时间敏感性又低。因此，快速、准确、简便的诊断是防治该病的关键，特别是寻找一种优势抗原对其诊断具有相当重要的意义，也能为FAVI抗体监测和流行病学调查提供可靠保证。

五邻体、六邻体和纤维蛋白是FAVI的三个主要结构蛋白，它们共同构成病毒核衣壳。其中，每个五邻体由基底和伸出表面的一根末端有顶球的纤维组成，有助于病毒黏附于细胞表面；五邻体还可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。研究表明，当腺病毒纤维蛋白太短时，五邻体通过其Arg-Gly-Asp(RGD)序列与细胞表面的整联蛋白作用，介导腺病毒的侵入和内化。同时，五邻体保守性较好，能刺激机体产生抗体中和病毒体。因此，五邻体蛋白在FAVI的致病性、诊断、预防与控制等方面具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确、简便、适于大批量检测的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，以便于I群禽腺病毒抗体的临床检测、流行病学调查和主动免疫效果检测。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗鸡IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，包被酶标板以I群禽腺病毒五邻体重组蛋白作为包被抗原。

I群禽腺病毒五邻体蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的截短的五邻体基因编码。

I群禽腺病毒五邻体重组蛋白来自大肠杆菌原核表达。

包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至1～30μg/mL，加入96孔酶标板，100μL/孔，置于37℃温育1h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，37℃温育1h，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为5％脱脂奶；包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

羊抗鸡IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG。

阴性标准血清是SPF鸡胚孵育所产2～5日龄雏鸡的血清；

阳性标准血清是经I群禽腺病毒模拟自然感染的方式滴鼻、点眼两次后的SPF鸡血清；

洗涤液是含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

稀释液是1％BSA；

底物液是TMB-H₂O₂溶液；

终止液是2M H₂SO₄。

磷酸盐缓冲液由NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，吐温-20 500uL，加蒸馏水定容至1000mL，调PH值到7.4制成。

TMB-H₂O₂溶液由TMB缓冲液10ml、TMB溶液0.5ml、H₂O₂ 32ul组成；TMB缓冲由Na₂HPO₄ 18.27g，柠檬酸4.665g，用900mL溶解，调PH至5.5，加水至1000mL制成；TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB 10mg制成。