[发明专利]静注人免疫球蛋白的制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种静注人免疫球蛋白的制备方法。

【背景技术】

目前，已知的血浆蛋白成分超过200种，已经能够分离纯化出来的有100余种，其中研究较多的有70多种。血浆蛋白成分除白蛋白和免疫球蛋白外，其余含量较少，而且各成分间含量差异极大。

按照生理功能，血浆蛋白可分为转输蛋白类、免疫球蛋白类、凝血系统蛋白类和蛋白酶抑制物；按照临床应用，血浆蛋白又可分为白蛋白类、免疫球蛋白类、凝血因子类和微量蛋白类。

血浆蛋白制品原为战争需求的产物。在第二次世界大战期间，由于战事的扩大，伤员急需大量的血液进行治疗，而新鲜血液的缺陷和供应不足，贻误了伤员救治的时间。美国哈佛大学接受军方委托E.J.Cohn教授领导一个研究组着手建立血浆蛋白的的分离工艺，并于1941年制备出白蛋白供临床观察。1942年Cohn法大规模生产白蛋白供美军使用，之后至1943年间，免疫球蛋白、纤维蛋白原制剂、凝血酶原、抗血友病球蛋白以及凝血酶原复合物也相继生产。Cohn等人建立了经典的低温乙醇工艺。1962年，瑞士红十字会的Nitschmann和Kistler对低温乙醇法进行改良，建立了Nitschmann-Kistler低温乙醇蛋白分离法。

低温乙醇法制备血浆蛋白主要是往蛋白水溶液中加入水溶性有机溶剂，如乙醇、丙酮等。加入水溶性有机溶剂后将会产生几种效应，主要效应是降低水分子的活度、降低溶液的介电常数，从蛋白质分子周围排代水分子，使蛋白质分子与蛋白分子通过极性基团的相互作用，在范德华引力下发生凝聚.。绝大多数血液制品生产厂家仍在采用传统的Cohn和Nitschmann-Kistler低温乙醇工艺制备静注人免疫球蛋白。

采用上述低温乙醇工艺制备静注人免疫球蛋白，IgG(免疫球蛋白G)制剂中含有少量IgG聚合体、PKA(激肽释放酶原激活剂)以及IgA(免疫球蛋白A)。IgG聚合体能启动补体结合反应，一些被激活的补体有过敏毒素作用和细胞毒作用，使血管通透性增加，平滑肌收缩，释放组织胺，破坏细胞膜等，从而引起病理生理反应。PKA能激活激肽释放酶，作用于激肽原，产生缓激肽BK，缓激肽BK有平滑肌收缩，毛细血管透性增高，白细胞游走和聚集作用，可使人体血压下降，甚至休克。IgG制剂中的少量IgA，一般无大妨碍，但是给IgA缺乏的患者注射可使之致敏产生抗体，再次注射可发生急性过敏反应。

【发明内容】

有鉴于此，本发明提供一种提高IgG制剂的纯度的静注人免疫球蛋白的制备方法。

一种静注人免疫球蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

从血浆中沉淀组分I+II+III：将低温冰冻血浆融化为液体状态，加入95％的-15℃药用乙醇至最终乙醇浓度至20％，同时调节pH至6.9～7.0，血浆蛋白含量5.0％，调控温度至-5℃，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分沉淀I+II+III；

从组分I+II+III中沉淀组分I+III：在组分I+II+III沉淀加入10倍注射用水重溶解，加入95％的-15℃药用乙醇至最终乙醇浓度至17％，同时调节pH至5.0～5.4，悬液蛋白含量0.8～1.2％，调控温度至-5℃，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集上清液；

从上清液中沉淀组分II：将上清液调节pH至7.0～7.2，蛋白质含量0.5％，加入95％的-15℃药用乙醇至最终乙醇浓度至25％，调控温度至-7℃，搅拌1小时以上，静置8小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分II沉淀；

将组分II进行阴离子交换层析；

将层析流出液进行超滤；

以及将超滤后的制品溶液进行除菌过滤。

优选地，所述将组分II进行阴离子交换层析的步骤进一步包括以下步骤：按组分II沉淀重量5～8倍加入0～2℃注射用水搅拌至完全溶解，静置30分钟将溶解液深层过滤；以及过滤液采用0.9％氯化钠溶液调电导率至1.9±0.1ms，用0.5mol/L盐酸调pH值6.30±0.10上平衡后的层析柱，处理至流出液电导率1.9±0.1ms、pH为6.30±0.10后上待处理制品。

优选地，在所述将组分II进行阴离子交换层析的步骤中，所用凝胶的平衡程序如下：2～3倍凝胶体积注射用水洗涤；3倍凝胶体积0.5mol/L氢氧化钠溶液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；6倍凝胶体积醋酸盐缓冲液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；以及6～9倍凝胶体积磷酸盐缓冲液。