[发明专利]一种利用木质纤维素制备L-乳酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及通过微生物发酵生产有机酸的技术领域，具体涉及利用一株改造的厌氧梭菌菌株降解木质纤维素发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术

L-乳酸(L-lactic acid)是在生物发酵过程中通过L-乳酸脱氢酶的催化作用下将丙酮酸转换而成的左旋乳酸。与D-乳酸相比，由于L-乳酸可直接参与人体代谢、无任何副作用等良好的生物相融性，其被广泛应用于食品、医药、化工等领域。

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，但只有极少数被有效利用，绝大部分被作为废物弃置在环境中，比如城市垃圾，反而造成环境污染。我国是农业大国，每年的农林废弃物总量约15亿吨，所以利用木质纤维素作为原材料生产各类生物燃料以及化工产品具有广阔的应用前景。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，分别占35-50％，20-35％，以及10-15％。由于其结构极其复杂，导致其降解十分困难。

整合生物加工技术(Consolidated BioProcessing，CBP)针对当前木质纤维素利用技术中采用单元操作与集成优化模式面临的诸多挑战，通过将纤维素酶的生产、纤维素的酶水解、戊糖发酵与己糖发酵等原本分立的反应步骤进行整合，大大简化了生产工艺并有效地降低了成本，从而提高纤维素生物转化利用的综合技术经济指标。基于这些显著的特色，CBP被认为是最有前景的低成本纤维素生物转化利用技术路线之一。

热纤梭菌(Clostridium thermocellum)是目前被认为最有希望满足CBP要求的微生物类群之一。热纤梭菌能够在高温厌氧条件下发酵，其产生的纤维小体是目前最高效的结晶纤维素水解体系。热纤梭菌不仅可以直接将纤维素转化为单糖，并将水解产生的纤维寡糖及葡萄糖发酵为乳酸等在工业、食品业等领域有广泛应用的高附加值产品。因此，在工业化应用的前景上，热纤梭菌比目前正在使用的酵母、大肠杆菌和运动发酵单孢菌等非纤维素降解菌具有更加显著的优势。然而，野生型热纤梭菌的乳酸生产能力较低，远不能达到工业化生产要求。

本方法是建立在一株通过遗传改造获得的热纤梭菌菌株CT-ak/dh的基础之上的。在保持野生菌株能够快速降解纤维素的特点前提下，该改造菌株在强化了乳酸合成途径的同时切断了其乙酸合成的途径，从而将源于糖酵解的大部分代谢流导向乳酸发酵的方向，使得利用木质纤维素发酵生产乳酸成为可能。本方法利用该改造菌株建立并优化了木质纤维素发酵制备L-乳酸的方法，从而大大降低乳酸生产成本，具有良好的工业应用前景。

发明内容

本发明包括建立一株遗传改造的厌氧梭菌菌株CT-ak/dh，以及以该菌株发酵降解预处理秸秆(木质纤维素)来生产L-乳酸两部分内容。所要解决的技术问题可以通过以下方案来实现：

1.热纤梭菌的遗传改造

本发明使用的起始菌株为Clostridium thermocellum。

为敲除目的基因，构建的质粒包括pHK01(敲除质粒骨架，含有下列原件：a大肠杆菌的复制起点ColE1和热纤梭菌的复制起点pno；b热纤梭菌识别的复制其实起始蛋白repB；c氯霉素(chloramphenicol)抗性基因cat；d大环内酯类抗生素(macrolide-lincosamide-streptograminB)抗性基因mls)，以及在pHK01基础上构建的敲除质粒pHK02，用于敲除热纤梭菌基因组上的基因Cthe_1028(乙酸激酶)。为表达外源基因，首先在pIMP1或pHK01的基础上加入厌氧荧光蛋白的编码基因PpFbFP，构建的质粒定义为质粒pEM01或pEK01，后在二者基础上加入待表达基因序列，构建表达质粒pEM02或pEK02。

如图1所示，将上述质粒通过电转化导入到相应的宿主菌株中从而获得相应的目的菌株。本发明中的基因敲除方法是基于同源重组的原理进行的，即根据热纤梭菌基因组上目的基因两侧的核酸序列，分别设计约1kb长得同源臂序列，并构建在相应的敲除载体上，通过同源臂的交换重组，使得基因组上的目的基因置换到质粒上来，再经过相应的筛选步骤从而达到基因敲除的目的。外源基因的表达是通过pEM02或pEK02上增加启动子和转录终止子原件来控制的，所选用的启动子见表1。

表1.本发明所采用的启动子种类

通过一系列的遗传改造，实现了对热纤梭菌基因组中乙酸激酶编码基因的敲除，并将L-乳酸脱氢酶(ldh)进行了异源表达，从而获得菌株CT-ak/ldh。选择的外源基因来源见表2。

表2.本发明中进行异源表达的外源基因来源