[发明专利]一种利用木质纤维素制备L-乳酸的方法

权利要求书

1.一种利用木质纤维素制备L-乳酸的方法，所述方法包括：嗜热厌氧梭菌的遗传改造方法和发酵优化培养方法。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于所述嗜热厌氧梭菌是能够利用纤维素生产乳酸的梭菌(Clostridium)，包括热纤梭菌(Clostridium thermocellum)衍生的菌株。

3.按照权利要求1-2的方法，其特征在于所述遗传改造方法包括电转化、基因敲除和基因异源表达的方法。

4.按照权利要求3的方法，其所述电转化的方法是基于专利201110048349.9描述的方法进行的。

5.按照权利要求3的方法，其所述基因敲除的方法是基于同源重组的原理进行的。

6.按照权利要求1-5的方法，其所述基因敲除的方法是通过构建pHK系列质粒，并转化到相应宿主细胞中进行的。

7.按照权利要求6的方法，其所述的pHK系列质粒包括pHK01和pHK02，以及按照本发明所描述构建方法以pHK01和pHK02为基础构建的其他质粒。

8.按照权利要求1-5的方法，其所述基因表达的方法是通过构建pEK系列质粒以及pEM系列质粒，并转化到相应宿主中进行的。

9.按照权利要求8的方法，其所述的pEK系列质粒包括pEK01和pEK02，以及按照本发明所描述构建方法以pEK01和pEK02为基础构建的其他质粒。

10.一种能利用木质纤维素制备L-乳酸的菌株CT-ak/ldh，其特征是按照权利要求1-9的任意一项方法构建的。

11.按照权利要求10的改造菌株进行遗传改造的应用，其特征在于所述方法包括：

a)选定Cthe_1028(ak)作为敲除对象

b)选定ldh和PpFbFP作为异源表达的对象

c)构建敲除载体和表达载体

d)通过电转化向野生菌株导入敲除载体，获得突变株

e)通过电转化向突变株导入表达载体，获得改造菌株CT-ak/ldh。

12.按照权利要求10-11的改造菌株进行发酵培养，其特征在于所述方法包括：

a)所用的高密度发酵培养基配方为“KH₂PO₄1.0-1.5g/L，K₂HPO₄4.0-10.0g/L，氮源3.0-7.0g/L，MgCl₂·6H₂O 1.0-5.0g/L，CaCl₂·2H₂O 50-250mg/L，FeSO₄·6H₂O 0.5-2.5mg/L，cysteine hydrochloride 1.0-5.0g/L，resazurin 1.0-10.0mg/L，碳源10.0-40.0g/L，morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)5.0-20.0g/L，yeast extract 5.0-20g/L，sodiumcitrate·2H₂O 0.2-1.5g/L”。灭菌前调节pH为7.0-8.5。 

b)所用的碳源为纤维素质生物质，包含但不限于秸秆，木菊。

c)所用的氮源为有机或无机氮源，包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，硝酸钠，谷氨酸钠。

d)所用的发酵条件为“温度50-65℃，厌氧，罐压为0.05-0.5MPa，搅拌转速为30-100rpm，pH恒定为7.0-7.5左右，发酵时间为24-48h”。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征是所述发酵的方式分批发酵，补料-分批发酵，连续发酵或半连续发酵。