[发明专利]甘菊微管蛋白基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种遗传工程的DNA的分离、制备、纯化和应用，特别涉及一种编码植物蛋白质的基因的分离、制备纯化和应用，属于分子生物学的遗传工程领域。

背景技术

甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino]又名岩香菊，甘野菊，是菊科菊属的二倍体植物，为栽培菊花(C.×morifolium)的野生近缘种，是一种广布于我国华北山地的短日照盐生植物，目前已经作为栽培菊花研究上的模式植物得到深入研究。探讨其相关生物学问题，可以为解析栽培菊花主要观赏性状形成的机理提供参考资料，也为菊花分子育种研究奠定基础。目前关于甘菊抗逆和成花分子机理的研究已取得了一定的进展，但内参基因只有肌动蛋白基因Actin和26S rRNA基因可供使用。因此，发掘甘菊更多的内参基因，有利于提高基因表达模式研究的稳定性、可靠性和重复性。

在转录水平进行基因表达定量分析时，应用看家基因(Housekeeping genes)作为内参基因(Reference genes)对目标基因表达量进行校正是最为通用、可靠的方法。任何一种看家基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下恒定，理想的看家基因应该是参与植物基础新陈代谢过程中组成型表达的基因，如蛋白质代谢途径和糖代谢途径中的基因。目前较多使用的主要有甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、植物延伸因子基因(EF-1a)、多聚泛素基因(polyubiquitin，polyUB)、肌动蛋白基因(Actin)和微管蛋白中的α、β家族基因(α/β-tubulin)。

微管蛋白(tubulin)是细胞的一种骨架蛋白，参与细胞内胞质环流、形状维持、运动、分裂、分化、物质运输、信号转导以及极性建成等重要的生理活动，可以分为α、β、γ、δ、ε等多种亚家族，其中α-tubulin蛋白和β-tubulin蛋白组成一种异源二聚体蛋白，其基因通常呈现组成型表达，但是，大量研究表明α-tubulin基因在多种植物不同器官中是非组成型表达，例如：α-tubulin基因在高等植物中以小基因家族发挥作用，拟南芥、杨树、葡萄和大麦中的数目分别为6、8、7、5，这些基因按照其编码氨基酸C端的多态性可分为两类(I和II)，此两类α-tubulin基因在植物中的表达模式有很大差异，如欧洲山杨中的I类α-tubulin基因，除PtTUA7(即ClTUA基因的同源基因)外，其余成员均在木质部中表达丰度最高，而II类PtTUA基因在各器官中均表达丰度很低；拟南芥中的I类α-tubulin基因(AtTUA2/4)在各器官中组成型表达，而II类基因中的AtTUA1只在花部表达；大麦中，HvTUA2/4基因在叶部分生组织表达，HvTUA1/5在有丝分裂后期表达，而HvTUA3只在分裂中期微丝形成时表达。

目前，在甘菊抗逆和成花分子机理等基因表达分析的相关研究中通常选用肌动蛋白基因Actin和26S rRNA基因作为内参基因。然而，越来越多的研究证明仅使用Actin基因作为内参会造成实验的精确性降低。此外，很多研究均已表明核糖体RNA不适合用于内参在基因表达研究中使用，尤其是不同组织中的mRNA和rRNA含量比例不同，导致试验结果错误，例如在有丝分裂期间，18SrRNA明显减少或停止表达。

有研究者进行了菊属植物候选内参基因的筛选，如Gu等(参考文献：Gu C，Chen S M，Liu Z l，et al.Reference gene selection for quantitative real-time PCR in Chrysanthemum subjected to biotic and abiotic stress.Mol Biotechnol，doi：10.1007/s12033-011-9394-6)研究表明EF1-α基因在研究菊花响应生物胁迫时适用，而在水分胁迫过程中表达量变化较大；PP2A基因则与之相反，在生物胁迫过程中表现较差，在热、水分胁迫过程中表达恒定；而广泛使用的内参基因Actin在上述胁迫过程中均表现较差。因此，发掘出更稳定表达的甘菊内参基因，将有利于提高甘菊基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

发明内容