[发明专利]褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分子检测方法

说明书

 

（一）、方法领域

本发明基于伽马氨基丁酸受体突变的褐飞虱抗药性分子检测方法，属于生物方法领域，专用于褐飞虱对作用于昆虫γ-氨基丁酸受体（γ-GABA receptor）杀虫剂（包括狄氏剂、氟虫腈和丁烯氟虫腈）抗性靶标变异的高灵敏快速检测。

（二）、背景方法

我国是世界上农林生物灾害发生最严重的国家之一，生物灾害发生频繁，为害严重，损失巨大。目前全国范围内农作物有害生物发生种类高达1700多种，可造成严重危害的有100多种，2009年我国农作物有害生物发生面积达70亿亩次。有害生物抗药性快速增长，目前至少有30种农作物害虫对40种杀虫剂、20多种病原菌对各类现代选择性杀菌剂产生了不同程度的抗药性。病虫抗药性的暴发往往导致防治失败，如果补救防治不及时或不到位，将造成严重的经济损失，抗药性的产生同时导致更多的化学农药投入田间，对环境造成严重污染，对有益生物造成毁灭性的杀伤。我国每年因使用农药引起的中毒人数超过9万人；发生作物药害的面积约300万亩。由于化学农药过度和不当使用，不仅造成严重的生态环境污染（高达80%的农药漂移或流失到非靶标生物、土壤和水域中），而且成为农产品质量安全的隐患。农药残留和重金属污染超标是当前农产品质量安全的突出问题，已经成为国际市场对我国农产品设置绿色贸易壁垒的主要依据。

水稻是我国第一大粮食作物，常年播种面积4.77亿亩左右，占粮食播种面积的30％，总产量约2亿吨，产量占粮食总产的40％左右。水稻主要害虫，褐飞虱、二化螟等，成为威胁水稻产量的主要因素之一；抗药性的上升及由此导致的大量化学农药的使用，同时威胁着水稻品质和农业生产安全。随着2005-2006年褐飞虱对吡虫啉高抗性的产生，氟虫腈随着大量应用； 2009年10月1日氟虫腈被禁止在稻田使用，丁烯氟虫腈作为替代品种被广泛使用。室内筛选和田间监测都发现，褐飞虱对氟虫腈和丁烯氟虫腈都产生了一定水平的抗性，尤其是室内筛选品系抗性达到200倍以上。

目前关于褐飞虱抗药性的监测大都局限于生物测定，除了本实验室2006年报道了褐飞虱对吡虫啉的分子检测方法外，还未见其他快速检测方法报道。生物测定本身的局限性是的这种常规的检测方法不能检测早期抗性和低频率抗性等位基因。目前用于监测褐飞虱抗药性的生物测定方法主要有点滴法、浸苗法、浸茎法等。生物测定方法普片存在的缺点有：（1）灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性等位基因，尤其是抗性等位基因是隐性或不完全隐性时；（2）周期长：生物测定结果一般需要24 h以上，对特殊作用方式杀虫剂需要更长的时间，如内吸性杀虫剂、生长调节剂、取食阻断剂等；（3）对试虫数量要求大：测定一个标准曲线至少需要500头标准化试虫，对昆虫饲养的要求高。在褐飞虱对杀虫剂抗性日益上升之际，一种快速抗性检测方法变得十分重要，而普通的生物测定方法根本不能满足这些要求。

（三）、发明内容

发明目的

本发明的目的是针对现有方法中褐飞虱抗药性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高、人力要求高等问题，提供褐飞虱对作用于γ-氨基丁酸受体杀虫剂狄氏剂、氟虫腈和丁烯氟虫腈抗性的分子检测方法，到达准确性高、周期短、灵敏度高的目的。

技术方案

褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分子检测方法

a、单头褐飞虱2-3龄若虫基因组DNA的提取

（1）配制提取液A：1%（g/mL）SDS, 50 mmol/L Tris·HCl, 25 mmol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA，溶剂为超纯水；提取液B：3 mol/L KAC, PH 7.2，溶剂为超纯水。

（2）将试虫置于1.0 mL离心管中，液氮冰冻后用灭菌牙签捣碎，然后加入60 μL提取液A，并用另外60 μL A液清洗牙签；

（3）65 ℃水浴45 min，每隔15 min混匀一次；

（4）加入120 μL提取液B，混匀后冰浴1～2 h；

（5）10000×g离心15 min，将上清液转移到另一个灭菌离心管中；

（6）加入480μL预冷的无水乙醇，混匀，－20℃放置1～2h；

（7）10000×g离心15 min，倾尽上清液，收集沉淀，用70％（mL/mL）乙醇清洗1次；

（8）重复步骤(7)，37 ℃晾干或冷冻干燥沉淀，获得单头褐飞虱基因组DNA，加入50 μL双蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存备用；

b、PCR反应体系 25 μL