[发明专利]表达抑制小麦籽粒多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及表达抑制小麦籽粒多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。

背景技术

面粉白度是衡量面粉品质的重要性状之一，受许多遗传和环境控制。影响面条、馒头、饼干等面食品的外观和色泽，主要取决于类胡萝卜素(carotenoids)和多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO，EC 1.10.3.1)的含量。其中，多酚氧化酶(PPO)与小麦面粉及其面食品在加工、贮藏中的褐变直接相关(Baik，1995；Kruger，1994；Hatcher，1993)。同时，PPO种类的遗传变异和表达差异也决定小麦籽粒中的PPO总活性高低，从而直接或间接影响面粉的白度。

尽管籽粒中大部分PPO在磨粉过程中随糊粉层(麸皮)而被除去，但面粉中的残留足以严重影响面粉的白度、面食品的外观品质(如亮度、色泽)，并使其在贮藏过程中发褐发暗(Abrol，1970；Kruger，1994；Baik，1995；Park，1997；Anderson，2001；Okot-Kotber，2001；Soysal，2004；李军红，2000；葛秀秀，2003)。这种褐变严重影响小麦面粉及其面食品的品质，尤其是全麦食品，因而倍受面粉加工业和育种家关注。

普通小麦是异源六倍体，PPO多基因家族成员众多，在天然突变体和人工诱变体(如EMS诱变)中很难筛选到合适的隐性突变体，使传统杂交育种陷入了缺乏相应育种材料的困境。

为了克服传统育种方法(如诱变育种)的局限，利用遗传工程技术引入基因获得新性状或者消除基因去掉坏性状，已经广泛地、成功地应用于植物遗传改良和育种中。近年来，转录后的基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing，PTGS)已广泛地用于下调(down-regulate)植物代谢过程中的某些关键酶。

FAD2基因编码微生物脂肪酸ω6-脱氢酶，由于该酶催化油酸(C18:1Δ9)的Δ12位置引入一个双键，形成亚油酸(C18:2Δ9，12)，故又名Δ12-脱氢酶。FAD2在拟南芥基因组中为单拷贝。澳大利亚CSIRO Plant Industry的Smith和Waterhouse等人2000年在Nature报道，含有拟南FAD2内含子(Arabidopsis FAD2intron)和发夹结构(hairpin structure)的沉默载体能导致几乎100％的PTGS。这种增强沉默效应的构建方式是将内含子连接在发夹结构的正义臂和反义臂之间，即含内含子的发夹RNA(intron-containing hairpin RNA，ihpRNA)。该内含子的切除可能有助于发夹臂互补配对、并促进二聚体的形成，因而能大幅度提高沉默效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达小麦籽粒抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。

本发明所提供的表达小麦籽粒抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子是由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述C片段与所述A片段反向互补。

其中，所述B片段没有特别的限制，优选为真核生物基因的内含子，如FAD2内含子，所述B片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列2。

含有所述DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌、扩增所述DNA分子全长及其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有所述DNA分子的重组表达载体中启动所述DNA分子的启动子是小麦籽粒特异表达的高分子量谷蛋白亚基1Dx5的强启动子，其核苷酸序列具体可为序列表中序列3。

本发明的另一个目的是提供一种培育多酚氧化酶活性降低的小麦的方法。

本发明所提供的培育多酚氧化酶活性降低的小麦的方法，是将所述DNA分子导入小麦中获得多酚氧化酶活性降低的小麦。

本发明的再一个目的是提供一种培育面粉白度改善的小麦的方法。

本发明所提供的培育面粉白度改善的小麦的方法，是将所述DNA分子导入小麦中获得面粉白度改善的小麦。

序列表中的序列1所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。

本发明利用小麦籽粒特异表达的高分子量谷蛋白亚基1Dx5的强启动子来启动表达抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子，在转基因小麦中籽粒内源的ppo基因的表达明显受到抑制，PPO同功酶活性降低，在不影响小麦营养生长和抗逆性的前提下，可改善小麦面粉的白度。本发明将为小麦面粉白度的改良、品质育种提供理论依据、实验方法和育种材料，对我国小麦品质改良和优质品种选育具有重要意义。