[发明专利]布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的活性蛋白的制备方法，具体是一种布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法。

背景技术

热带寄生虫病是全球危害人类健康的重要疾病之一，它已经影响了世界范围内数亿人口，造成了大量的死亡，产生了严重的社会后果。非洲睡眠病(Africantrypanosomiasis)，也被称之为昏睡病，是因为致病性寄生虫锥虫入侵中央神经系统后所引起的昏睡而得名的。到目前为止，已上市的用于治疗非洲人类锥虫病的四种药物都存在着一些缺陷，药物毒性、缺乏胃肠外管理和有保障的供应以及出现的抗药性等都是需要解决的问题。

近年来，随着生物化学的大力发展，以及锥虫基因组序列的陆续破解，为我们寻找新的药物作用靶点提供了很好的基础。最近，氨酰tRNA合成酶(AARS)便成为研究者们开发该类药物的重点。通过抑制AARS的活力，可以抑制某些病原菌的蛋白质生物合成而抑制病原菌的生长，为人类设计新型药物提供新思路。已上市的莫匹罗星(商品名Bactroban)就是AARS抑制剂临床应用的一个重要实例。此外，人类许多疾病的发生与蛋白质生物合成精确性的失控有关。因此，研究AARS不仅具有重要的生物学意义，而且随着研究的深入还可以应用于人类疾病的防治，服务于人类的健康和改善人类生存环境。本发明主要是用基因工程的方法，构建布氏锥虫(Trypanosoma brucei)亮氨酸tRNA合成酶(LeuRS)的重组质粒，表达纯化出布氏锥虫亮氨酸tRNA合成酶蛋白，可以广泛的作为药物作用的靶标，从而为抗寄生虫药物的筛选奠定了基础。

经对现有技术的文献检索发现，孟宪芳、施静、刘晓春等在《中国病理生理杂志》2005年21卷第12期2407-2409页发表了题为《人类组氨酰tRNA合成酶类似物的原核表达及其多克隆抗体的制备》一文，文章中给出了表达纯化人类组氨酰tRNA合成酶类似物的方法，但是该方法对布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶的表达效率较低。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法。本发明所得的亮氨酰tRNA合成酶可以作为药物筛选的靶标，广泛的应用于药物筛选领域。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

步骤一，设计特异引物，扩增布氏锥虫全基因组；

步骤二，切胶回收，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶基因；

步骤三，将步骤二得到的基因连接到克隆载体中，构建基因克隆质粒；

步骤四，将克隆质粒亚克隆进表达载体，鉴定，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌单克隆，诱导；

步骤五，纯化表达的融合蛋白，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白。

步骤一中，所述特异性引物为，

GGCTGGCATATGTCGACTGTACGAC，TTCGGATCCGCTGCCTTCTTGTC。

步骤四中，所述培养具体为，将转化的大肠杆菌单克隆接种到含氨卞青霉素100μg/ml的LB培养基中，37℃过夜培养，之后将培养的菌液按体积分数为1‰的接种量接种到含氨卞青霉素的LB培养基的培养瓶中，培养至A₅₅₀OD为0.6-0.8时停止培养，冰上冷却。

步骤四中，所述诱导具体为向冷却后的菌液中加IPTG至其终浓度为0.2mM，20℃-25℃过夜。

本发明通过以下步骤得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白：PCR扩增布氏锥虫全基因组；得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶基因片段；构建基因克隆质粒；亚克隆进表达载体，鉴定，转化大肠杆菌，培养；最后纯化表达的融合蛋白。

本发明具有如下的有益效果：本发明所得的布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶可以作为抗锥虫药物体外筛选的靶标，广泛的应用于抗锥虫药物筛选与抗锥虫作用机制研究领域。

本发明中所涉及的菌株大肠杆菌DH5α已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963-969》文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。