[发明专利]一种产生诱导多能干细胞的细胞类型及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及一种可高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法。 

背景技术

干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somatic stem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。 

1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。而人的干细胞的代始于1998年，美国威斯康辛大学(University of Wisconsin)科学家汤姆森(James A.Thomson)带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES Cell)株，并且证实此株细胞具有全能干细胞特征，此项研究论文发表在1998年11月6日出版的顶级学术期刊Science上面。(详见：Thomson，J.A.，J.Itskovitz-Eldor，S.S.Shapiro，M.A.Waknitz，J.J.Swiergiel，V.S.Marshall，and J.M.Jones.″Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.″Science 282(1998)：1145-1147。Thomson等人，从人胚泡中获取胚胎干细胞系，科学，282(1998)：1145-1147。)这篇论文标志着一个时代的到来，而汤姆森也被人称作″干细胞研究之父″。 

hES(人胚胎干细胞)细胞研究的应用前景主要是再生医学领域，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。 

然而，一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(4)体外保持hES风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。 

为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nucleiof adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell geneexpression by amphibian oocytes.Curr Biol 2003；13：1206-1213。Byrne JA等人，成年哺乳动物体细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4.当代生物学，2003；13：1206-1213)。 

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而 在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)。