本发明属于分子标记领域,具体公开了一种鉴别狭叶重楼的分子标记在及其在定性鉴定狭叶重楼中的应用,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种鉴别狭叶重楼的分子标记方法,包括:以待测样品的基因组DNA为模板,利用引物对进行PCR扩增,得到的扩增产物用限制性内切酶Hpy99I酶切;对酶切产物进行电泳检测,若在125bp和361bp处检出两种条带,则所述待测样品中含狭叶重楼的生物组织。本发明获得的分子标记可用于鉴定狭叶重楼与滇重楼和七叶一枝花的幼苗或休眠根茎,以及药材是否为狭叶重楼或者药材中是否混有狭叶重楼的样本材料。