本发明提供了一种梅毒螺旋体抗体检测试剂盒及其应用,涉及生物技术领域。梅毒螺旋体抗体检测试剂盒包括:包括混合梅毒螺旋体膜多肽包被负电荷明胶粒子第一试剂;包括负电荷明胶粒子的第二试剂;样本稀释液;其中,混合梅毒螺旋体膜多肽包被负电荷明胶粒子由氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4的四种合成梅毒螺旋体膜多肽分别包被的负电荷明胶粒子混合制得。本发明试剂盒采用四种合成梅毒螺旋体膜多肽包被的负电荷明胶粒子,大幅提高了对梅毒螺旋体抗体检测的灵敏度、特异性。