[发明专利]一种制备重组链激酶的方法无效
| 申请号： | 94112106.2 | 申请日： | 1994-04-04 |
| 公开（公告）号： | CN1035193C | 公开（公告）日： | 1997-06-18 |
| 发明（设计）人： | 宋后燕 | 申请（专利权）人： | 上海医科大学 |
| 主分类号： | C12N9/70 | 分类号： | C12N9/70;C12N1/20;C12N15/57;C12N15/63;//C12N9/70;C12R146 |
| 代理公司： | 上海医科大学专利事务所 | 代理人： | 吴桂琴 |
| 地址： | 20003*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 一种重组链激酶的制备方法，现有技术的基因构建过程繁琐，大肠杆菌中表达水平低，纯化方案复杂。本发明方法用PCR扩增链激酶基因，与原核表达载体如PLY-4组装成表达质粒PSTE-SK-1，转化大肠杆菌后用温度诱导r-SK基因表达。工程菌经发酵扩增，破碎细菌，离心收集包涵体，复性后经二步法纯化r-SK。本方法所得产品的产量和纯度都很高，成本低。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 制备 重组 链激酶 方法 | ||
【主权项】：
1、一种重组链激酶的制备方法，包括链激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化，其物征在于：(1)从人口腔分离溶血性链球菌，培养液中提纯链激酶，测定其N末端和C末端氨基酸顺序作设计PCR引物的参考，用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与含有PL、PR启动子、CIT857基因以及5SRNA终止信号的原核表达载体PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-1；(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌K802(ATCC33526)，用温度诱导r-SK基因的表达，表达产物以包涵体形式存在于工程菌内；(3)通过发酵技术扩增工程菌，用温度诱导基因表达，发酵参数为温度28℃-42℃，氧溶量为50％-80％，pH6-8；(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤、离子交换二步法纯化产品。(5)构建的链激酶因的核苷酸顺序如下：ATGAAAAATTACTTATCTTITGGGATGTTTGCACTGCTGTTTGCATTAACATTTGGAMetLysAsnTyrLeuSerPheGlyMetPheAlaLeuLeuPheAlaLeuThrPheGly10ACAGTCAAGCCTGTCCAAGCTATTGCTGGGTCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTCThrValLysProValGlnAlaIleAlaGlySerGluTrpLeuLeuAspArgProSetVal2030AACAACAGCCAATTAGTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAsnAsnSetGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIle4050AGTCTTAAATTTTTTGAAATTCACCTAACATCACGACCTCCTCACGGAGGAAAGACAGAGSetLeuLysPhePheGluIleHisLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGlu6070CAAGGCTTAAGTCCAAAATCAAAACTATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCAAATAAAGlnGlyLeuSetProLysSetLysLeuPheAlaThrAspSetGlyAlaMetProAsnLys8090CTTGAAAAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGTLeuGluLysAlaAspLeuLeuLysAlaIleGlnGluGlnLeuIleAlaGlnValHisSet100ll0AACGACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAACAsnAspAspTyrPheGluValIleAspPheAlaSetAspAlaThrIleThrAspArgAsn120130GGCAAGGTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAAGlyLysValTyrPheValAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGln140150GAATTTTTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAATGluPheLeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsn160170CAAGCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGACGlnAlaLysSetValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAsp180190GATTTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACCAspPheArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlaIleGlyAspThr200210ATCACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCACCCAGGCIleThrSetGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerIleLeuAshLysThrHisProGly220230TATACGATTTATGAACGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGTyrThrIleTyrGluArgAspSerSerIleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThr240250ATTTTACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAAIleLeuProMetAspGlnGluPheThrTyrHisValLysAshAtgGluGlnAlaTyrGlu260270ATCAATAAAAAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAAIleAsnLysLysSerGlyLeuAsnGluGluIleAsnAshThrAspLeuIleSetGluLys280290TATTACGTCCTTAAAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAATyrTyrValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSetHisLeuLys3003l0CTGTTCACCATCAAATACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTCLeuPheThrIleLysTyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSetGluGlnLeu320330TTAACAGCTAGCGAACGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCTLeuThrAlaSerGluArgAshLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAla340350AAACTACTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAALysLeuLeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlyIleMetAspTyrThrLeuThrGlyLys360370GTAGAGGATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATAGTGGCAAGCGACCCValGluAspAsnHisAspAspThrAsnArgIleIleThrValTyrMetGlyLysArgPro380390GAAGGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAAGAAGAAGluGlyGluAsnAlaSetTyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGluGluGlu400410CGAGAAGTTTACAGCTACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGAGAACCCTAAAGACArgGluValTyrSerTyrLeuArgTyrThrGlyThrProIleProGluAsnProLysAsp420430AAATAALys440
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