[发明专利]一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法

摘要

本发明提供了一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素２（ｒＩＬ－２）的方法。其特点是先进行工程菌发酵，发酵后收集菌体，然后将菌体裂解，采用盐酸胍变性剂进行抽提、纯化，并用３—６Ｍ盐酸胍进行凝胶层析，用还原型和氧化型谷胱甘肽复性，并采用ＨＰＬＣ层析，经乙腈梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈后，即得到ｒＩＬ－２纯品。

主权项

1.一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2(rIL-2)的方法，其特征在于：(1)挑选一种表达重组人白细胞介素2的重组大肠杆菌单菌落(pBV324/IL-2/JM103)，接种于LB培养基的摇瓶中，30℃扩增培养10小时，再转种于含有合成培养基的20立升发酵罐中发酵(30℃培养12小时后，42℃培养5-6小时)。(2)离心(4000rpm×30分钟)收集菌体，重新悬于pH8.5，50mMTris.HCl-1mMEDTA-1mMDTT缓冲液中。加溶菌酶于4℃作用30分钟，冰浴超声至菌体完全破裂为止，离心(12000rpm×10分钟)得包涵体沉淀。(3)将沉淀悬于pH8.5，50mMTris.HCl-1mMEDTA-2mMDTT溶液，室温下缓慢滴加等体积pH8.5，50mMTris.HCl-1mMEDTA-8M尿素，搅拌30分钟，经12000rpm×15分钟离心，得到60-70％的包涵体沉淀。(4)将沉淀溶于pH8.5，50mMTris.HCl-1mMEDTA-8MGuHCl(7-8MGuHCl均可)，溶解1.5小时后离心(12000rpm×20分钟)收集上清液。(5)取上清液进行SephacrylS-200凝胶层析，用pH8.5，50mMTris.HCl-6MGuHCl(3-6MGuHCl均可)做平衡液及洗脱液，流速800ml/小时，收集含有重组人介素2的蛋白峰。(6)复性：将收集的峰用pH8.5，50mMTris.HCl稀释三倍，加终浓度为1-10mM还原型谷胱甘肽和终浓度为1mM氧化型谷胱甘肽，室温放置2小时。(7)复性后蛋白溶液经超滤浓缩10倍，用SepgadexG-25凝胶脱盐；收集的蛋白峰进行反相高效液相层析，用乙腈进行梯度洗脱(40-80％)，流速为40ml/分钟，收集rIL-2活性峰，低温减压快速去除乙腈，得到rIL-2纯品。