[发明专利]一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法

说明书

本发明涉及一种用于增强人体免疫力和抗肿瘤药物的制取方法。

白细胞介素2(InterLeukin 2，IL-2)是一种T细胞分泌的免疫调节因子，不仅能促进T细胞的增殖，还可增强NK等多种免疫活性细胞的活性，在免疫反应的产生、调节及免疫监视中起重要作用。近年来因其在肿瘤治疗中所起的重要作用而越来越受到人们的关注。自从1983年Tanig Uchi等首次克隆IL-2cDNA并成功地在猴细胞系COS-7中表达出IL-2以来，许多学者相继在E.Coli中表达成功。由于重组白细胞介素2(rIL-2)具有天然IL-2的全部功能，用基因工程方法大量生产rIL-2将满足实验室及临床应用的要求。目前rIL-2制备均遵循以下工艺路线进行：

1、包含体纯化：rIL-2基因在大肠杆菌中表达时，产生的rIL-

   2以不溶性包含体形式存在于胞质中。工程菌发酵并完成表

   达后，一般先用超声或匀浆法破碎细菌，离心后收取沉淀以

   去除可溶性蛋白等成份，接着用4M尿素处理以溶解部分杂蛋

   白。有的工艺中还用仲丁醇抽提以进一步除杂蛋白以及用正

   丁醇等处理消除脂类。经上述步骤处理后，可以得到较纯净

   的包含体，rIL-2纯度在70％以上。

2、凝胶层析：包含体不溶于水，需用一种变性剂将其溶解后才

   能进一步纯化。包含体溶解后所产生的rIL-2单体也是疏水

   性的，必须用一定浓度的变性剂维持其溶解状态才能进行凝

   胶层析。目前大多数厂家均采用十二烷基磺酸钠(SDS)为变

   性剂，以2％浓度溶解包含体，1％左右浓度平衡凝胶柱并洗

   脱样品，凝胶柱一般使用Sephacryl S-200，使用SDS做变

   性剂有很大的缺点，即SDS属于去污剂，溶解rIL-2时将在

   其分子上大量束缚，一旦与蛋白质结合很难除去，对人体具

   有较强的毒性作用。注入人体内达一定量时将引起溶血。即

   使用各种方法较干净地除去SDS，一个rIL-2分子一般仍至

   少与一个SDS分子结合，此时使用高剂量rIL-2时，仍可引

   起肝脏损害。由于使用rIL-2治疗肿瘤等疾病时，一般均采

   用较高浓度，所以用SDS作为变性剂必将产生许多限制。

3、复性：复性前的rIL-2分子属还原态，分子内无二硫键，不

   具有生物活性，必须经过氧化作用在分子内恰当部位即半胱

   氨酸之间形成二硫键，恢复其正常的分子结构才能得到有用

   的rIL-2，此过程即为复性。复性是影响其回收率乃至质量

   的关键步骤。目前所采用的复性方法是：先用Sephadx G-25

   柱除去大部分SDS，再调整蛋白的浓度，然后加一定浓度的

   铜离子做氧化剂完成复性。该方法的主要缺点是复性率较低，

   一般只能达到30-35％。

4、高效液相色谱。经凝胶层析和复性后，rIL-2纯度还达不到

   标准，需要进一步的精提。目前绝大多数厂家在最后一步提

   纯中均采用反相高效液相色谱，主要使用碳18柱、0.1％三氟

   乙酸平衡后上样，乙睛梯度洗脱，收集rIL-2洗脱峰，除去

   乙睛后得到rIL-2纯品。

本发明的目的是提供一种不使用SDS，且不残留毒性杂质，复性率高的重组人白细胞介素2(rIL-2)的分离和纯化方法。本发明的目的是这样实现的，其技术方案要点是：1、挑选含有编码人IL-2的DNA序列的单菌落(人rIL-2生产   菌菌株)接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30℃下振荡培   养8-10小时，转入含有合成培养基的发酵罐中，30℃下培   养11-13小时，再在42℃下培养5-6小时，发酵后收集菌   体；2、取菌体，用pH8.5，浓度为5mM