[发明专利]一种利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法，包括：巨大芽孢杆菌菌体经喷雾干燥制成菌粉与无水乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，将该提取液减压浓缩至总体积的1/10‑1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；然后常压硅胶柱层析得浓缩液；再次常压硅胶柱层析，得到浓缩组分；凝胶柱层析，得到目标粗品；减压硅胶柱层析、干燥得白色粉末，即为二十二酸。本发明工艺简单，成本经济、操作易行、过程环保、污染低、培养基质容易获得。

主权项

1.一种利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法，包括以下步骤：（1）粗提物的制备巨大芽孢杆菌菌体经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与无水乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，将该提取液减压浓缩至总体积的1/10‑1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；（2）常压硅胶柱层析将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40～80目硅胶拌样，两者体积比为1:1.2，水浴挥干乙酸乙酯后上柱；用体积比100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1,乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为15 mL/min，薄层层析色谱,5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色，通过分析Rf值判断是否为所需物质，分段收集装置收集、合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至总体积的1/5，得浓缩液；（3）再次常压硅胶柱层析选取步骤（2）中的浓缩液对青枯雷尔氏菌抑菌活性活性最好的组分，采用常压硅胶柱层析进行初步分离，洗脱组分与40~80目硅胶按质量比1:1.5进行拌样，柱层析硅胶200~300目装柱，选择冲柱系统为体积比石油醚：乙酸乙酯为40:1、20:1、10:1，纯甲醇进行梯度洗脱，经TLC色谱和显色分析收集相似洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得到浓缩组分；（4）凝胶柱层析将浓缩组分用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后用葡聚糖凝胶Sephadex LH‑20进行进一步分离，分段收集收集装置收集，经薄层层析色谱分析合并相似洗脱组分，减压浓缩至总体积的1/5，得到目标粗品；（5）减压硅胶柱层析将步骤（4）中目标粗品进行硅胶减压柱洗脱，洗脱组分与40~80目硅胶按质量比1:1.5进行拌样，以体积比石油醚：乙酸乙酯为10:1、2:1，纯甲醇体系冲柱，分段收集装置收集，经TLC色谱和显色分析Rf值后合并相似洗脱组分，减压浓缩至有机溶剂挥干、干燥得白色粉末，即为二十二酸。