[发明专利]一种利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法，包括：巨大芽孢杆菌菌体经喷雾干燥制成菌粉与无水乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，将该提取液减压浓缩至总体积的1/10‑1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；然后常压硅胶柱层析得浓缩液；再次常压硅胶柱层析，得到浓缩组分；凝胶柱层析，得到目标粗品；减压硅胶柱层析、干燥得白色粉末，即为二十二酸。本发明工艺简单，成本经济、操作易行、过程环保、污染低、培养基质容易获得。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法。

背景技术

二十二酸（Behenic Acid）是一种化学物质，分子式是C₂₂H₄₄O₂，分子量是340.58，可用于制造山嵛醇、山嵛酸酯、山嵛酸酰胺，广泛用于纺织、石油、洗涤剂、化妆品等行业，也可用作有机合成，用作高级乳化制品的油相原料或高熔点的软膏制品，还可用作香皂的乳化剂、胶凝剂和固化剂，医药杀真菌剂和农业杀虫剂。文献报道二十二酸的合成方法甚少，通常有二十二醇合成法等化学合成法，以及从硬化菜油和硬化鱼油、花生油、菜籽油、芥子油中用蒸馏、精制、分离的方法提纯制得，但产量低，成本高，极大地影响了产品的价值和竞争力。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种工艺简单，成本经济、操作易行、过程环保、污染低、培养基质容易获得的利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法。

本发明的一种利用巨大芽孢杆菌分离提取二十二酸的方法，包括以下步骤：

（1）粗提物的制备

巨大芽孢杆菌菌体经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与无水乙醇，在压力为0.04-0.06MPa、温度为40-60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，将该提取液减压浓缩至总体积的1/10-1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；

（2）常压硅胶柱层析

将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40～80目硅胶拌样，两者体积比为1:1.2，水浴挥干乙酸乙酯后上柱；用体积比100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1,乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为15 mL/min，薄层层析色谱,5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色，通过分析Rf值判断是否为所需物质，分段收集装置收集、合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至总体积的1/5，得浓缩液；

（3）再次常压硅胶柱层析

选取步骤（2）中的浓缩液对青枯雷尔氏菌抑菌活性活性最好的组分，采用常压硅胶柱层析进行初步分离，洗脱组分与40~80目硅胶按质量比1:1.5进行拌样，柱层析硅胶200~300目装柱，选择冲柱系统为体积比石油醚：乙酸乙酯为40:1、20:1、10:1，纯甲醇进行梯度洗脱，经TLC色谱和显色分析收集相似洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得到浓缩组分；

（4）凝胶柱层析

将浓缩组分用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进行进一步分离，分段收集收集装置收集，经薄层层析色谱分析合并相似洗脱组分，减压浓缩至总体积的1/5，得到目标粗品；

（5）减压硅胶柱层析