[发明专利]一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法

摘要

本发明公开了一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法，利用蜗牛酶和β葡聚糖酶酶解白腐真菌lg‑9、JM‑70S8获得其原生质体；通过PEG介导的方法将含有潮霉素B抗性标记的质粒pUC18‑Hyg转入白腐真菌的原生质体；在潮霉素B选择性培养基上筛选转化子；选取转化成功的转化子，通过PCR方法检测质粒的插入情况，通过酶解的方法成功获取白腐真菌原生质体，在潮霉素B浓度为40μg/ml的选择性培养基上筛选并获得了数个转化子，计算得到5‑6个转化子/μg DNA的转化频率，通过PCR的方法可成功获取目的片段。本发明的有益效果是能够有效获得以潮霉素为抗性标记的白腐真菌遗传转化筛选体系。

主权项

1.一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法，其特征在于：一、准备菌株与培养基：菌株：粗毛栓菌lg‑9、JM‑70S3和JM‑70S8；培养基：PDA固体培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然值，115℃灭菌30min；PDA液体培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，pH自然值，115℃灭菌30min；液体菌丝生长培养基：液体PDA另加玻璃球；上层软洋菜培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂0.5％，pH自然值，115℃灭菌30min；菌株选择性培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然值，115℃灭菌30min，按照所要获得培养基中的潮霉素B浓度，加入相对应浓度的潮霉素B；原生质体选择性再生培养基：采用双层琼脂法，上层为PDA固体培养基，下层为软洋菜培养基，按照所要获得培养基中的潮霉素B浓度，在上层和下层培养基中分别加入相对应浓度的潮霉素B；LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，水加至1000ml，固体培养基补加1.5％的琼脂；二、质粒DNA所用质粒pUC18‑Hyg由pUC18质粒与出芽短梗霉翻译延长因子启动子和潮霉素抗性基因连接而成；三、白腐真菌原生质体的制备1)将新鲜的活化菌株JM‑70S8和lg‑9接种到50mL PDA液体培养基中，30℃培养58‑60h；2)在漏斗上面覆盖4层纱布，滤掉菌液，收集菌体，然后用无菌水冲洗3次；3)用0.8M的MgSO₄溶液冲洗1次；4)菌体置于无菌三角锥瓶中，悬浮于经过滤除菌的15mL 1％蜗牛酶+1％葡聚糖酶溶液，进行酶解，制备原生质体；5)将上述溶液放于恒温震荡培养箱中，设置30℃培养，转速为120rpm，培养3.5‑4h后，前两个小时每隔一小时观察一次，此后每隔半小时观察一次；6)在显微镜下观察到原生质体酶解好后，向上述溶液加入等体积的1.2MSorbital溶液；7)再将上述溶液用3‑4层纱布过滤，除去残余的菌丝体，用灭菌的EP管收集原生质体液；8)将上述原生质体液置于离心机里，设置转速3000rpm，在室温下离心5min；9)离心后，去上清，然后用Sorbitol溶液冲洗沉淀两次，每次都置于离心机内，设置转速3000rpm，在室温下离心5min；10)弃上清液，将原生质体悬浮于200μl Sorbitol溶液中；11)将获得的原生质体置于PDA固体培养基中，在30℃3天条件下培养3天，观察原生质体再生情况；12)用200目标准筛过滤，收集滤液2800rpm室温离心8min，除去上清液，保留原生质体沉淀，用1mL 1.2M Sorbitol清洗两次，每次2800rpm室温离心8min，除去上清液，用200μL 1.2M Sorbitol将原生质体重新悬浮。梯度稀释原生质体至10⁷数量级，留作原生质体生长最低浓度的探索以及转化使用；13)将获得的原生质体，加入到事先融化好的上层菜培养基中，混匀，倒入盛有下层PDA培养基的平板中，放入恒温培养箱中静置培养，上层软洋菜培养基和下层PDA固体培养基中都要提前加好一定浓度的潮霉素B试剂，用以观察菌株在带有不同浓度潮霉素B的培养基中的再生情况，确定原生质体对于潮霉素B的最低抑菌浓度；四、白腐真菌原生质体的转化(1)向100μL原生质体中加入10μL质粒；(2)加入50μLPEG缓冲液，吹打混匀，冰上静置30min；(3)加入1mLPEG缓冲液，吹打混匀后室温静置20min；(4)加入1mL Sorbitol，将体系与不太烫的软洋菜混匀，铺在含有40μg/mL潮霉素B的PDA固体平板上，软洋菜培养基凝固后，用封口膜封口，30℃恒温静置培养，24h后倒置培养并观察。