[发明专利]一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法

权利要求书

1.一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法，其特征在于：

一、准备菌株与培养基：

菌株：粗毛栓菌lg-9、JM-70S8；

培养基：

PDA固体培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然值，115℃灭菌30min；

PDA液体培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，pH自然值，115℃灭菌30min；

液体菌丝生长培养基：液体PDA另加玻璃球；

上层软洋菜培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂0.5％，pH自然值，115℃灭菌30min；

菌株选择性培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然值，115℃灭菌30min，按照所要获得培养基中的潮霉素B浓度，加入相对应浓度的潮霉素B；

原生质体选择性再生培养基：采用双层琼脂法，上层为PDA固体培养基，下层为软洋菜培养基，按照所要获得培养基中的潮霉素B浓度，在上层和下层培养基中分别加入相对应浓度的潮霉素B；

LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，水加至1000ml，固体培养基补加1.5％的琼脂；

二、质粒DNA

所用质粒pUC18-Hyg由pUC18质粒与出芽短梗霉翻译延长因子启动子和潮霉素抗性基因连接而成；

三、白腐真菌原生质体的制备

1)将新鲜的活化菌株JM-70S8和lg-9接种到50mL PDA液体培养基中，30℃培养58-60h；

2)在漏斗上面覆盖4层纱布，滤掉菌液，收集菌体，然后用无菌水冲洗3次；

3)用0.8M的MgSO ₄溶液冲洗1次；

4)菌体置于无菌三角锥瓶中，悬浮于经过滤除菌的15mL 1％蜗牛酶+1％葡聚糖酶溶液，进行酶解，制备原生质体；

5)将上述溶液放于恒温震荡培养箱中，设置30℃培养，转速为120rpm，培养3.5-4h后，前两个小时每隔一小时观察一次，此后每隔半小时观察一次；

6)在显微镜下观察到原生质体酶解好后，向上述溶液加入等体积的1.2MSorbital溶液；

7)再将上述溶液用3-4层纱布过滤，除去残余的菌丝体，用灭菌的EP管收集原生质体液；

8)将上述原生质体液置于离心机里，设置转速3000rpm，在室温下离心5min；

9)离心后，去上清，然后用Sorbitol溶液冲洗沉淀两次，每次都置于离心机内，设置转速3000rpm，在室温下离心5min；

10)弃上清液，将原生质体悬浮于200μl Sorbitol溶液中；

11)将获得的原生质体置于PDA固体培养基中，在30℃3天条件下培养3天，观察原生质体再生情况；

12)用200目标准筛过滤，收集滤液2800rpm室温离心8min，除去上清液，

保留原生质体沉淀，用1mL 1.2M Sorbitol清洗两次，每次2800rpm室温离心8min，除去上清液，用200μL 1.2M Sorbitol将原生质体重新悬浮；梯度稀释原生质体至10 ⁷数量级，留作原生质体生长最低浓度的探索以及转化使用；

13)将获得的原生质体，加入到事先融化好的上层软洋菜培养基中，混匀，倒入盛有下层PDA培养基的平板中，放入恒温培养箱中静置培养，上层软洋菜培养基和下层PDA固体培养基中都要提前加好一定浓度的潮霉素B试剂，用以观察菌株在带有不同浓度潮霉素B的培养基中的再生情况，确定原生质体对于潮霉素B的最低抑菌浓度；

四、白腐真菌原生质体的转化

(1)向100μL原生质体中加入10μL质粒；

(2)加入50μLPEG缓冲液，吹打混匀，冰上静置30min；

(3)加入1mLPEG缓冲液，吹打混匀后室温静置20min；

(4)加入1mL Sorbitol，将体系与软洋菜混匀，铺在含有40μg/mL潮霉素B的PDA固体平板上，软洋菜培养基凝固后，用封口膜封口，30℃恒温静置培养，24h后倒置培养并观察。