[发明专利]一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法

说明书

本发明公开了一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法，利用蜗牛酶和β葡聚糖酶酶解白腐真菌lg‑9、JM‑70S8获得其原生质体；通过PEG介导的方法将含有潮霉素B抗性标记的质粒pUC18‑Hyg转入白腐真菌的原生质体；在潮霉素B选择性培养基上筛选转化子；选取转化成功的转化子，通过PCR方法检测质粒的插入情况，通过酶解的方法成功获取白腐真菌原生质体，在潮霉素B浓度为40μg/ml的选择性培养基上筛选并获得了数个转化子，计算得到5‑6个转化子/μg DNA的转化频率，通过PCR的方法可成功获取目的片段。本发明的有益效果是能够有效获得以潮霉素为抗性标记的白腐真菌遗传转化筛选体系。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种以潮霉素B抗性基因为选择标记的白腐真菌遗传转化体系的构建方法。

背景技术

白腐真菌lg-9合成的漆酶是白漆酶，属于非典型性漆酶，其具有的光谱学特征是在610nm处不具备可见光特征吸收峰。非典型性漆酶和普通漆酶相比较而言，有很多优点：前者的热稳定性更好；前者pH的适用较广，整体偏酸性，适用范围更广；前者能够独立氧化非酚型化合物甲基红和稠环化合物茜素红，应用前景广阔等。JM-70S8是lg-9经紫外照射诱导筛选得到的漆酶高产菌株。至于以是漆酶基因型改变，还是调节漆酶代谢途径改变以及如何定点突变菌体使其高产还有待于进一步研究。本发明构建了针对白腐真菌的原生质体遗传转化体系，为从分子水平上研究该菌，进而为改造菌体使其漆酶高产或活性升高奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白腐真菌遗传转化体系的构建方法，本发明的有益效果是能够有效获得以潮霉素为抗性标记的白腐真菌遗传转化筛选体系。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

一、准备菌株与培养基：

菌株：粗毛栓菌lg-9、JM-70S3和JM-70S8；

培养基：

PDA固体培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然值，115℃灭菌30min；

PDA液体培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，pH自然值，115℃灭菌30min；

液体菌丝生长培养基：液体PDA另加玻璃球；

上层软洋菜培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂0.5％，pH自然值，115℃灭菌30min；

菌株选择性培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然值，115℃灭菌30min，按照所要获得培养基中的潮霉素B浓度，加入相对应浓度的潮霉素B；

原生质体选择性再生培养基：采用双层琼脂法，上层为PDA固体培养基，下层为软洋菜培养基，按照所要获得培养基中的潮霉素B浓度，在上层和下层培养基中分别加入相对应浓度的潮霉素B；

LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，水加至1000ml，固体培养基补加1.5％的琼脂；

二、质粒DNA

所用质粒pUC18-Hyg由pUC18质粒与出芽短梗霉翻译延长因子启动子和潮霉素抗性基因连接而成；

三、白腐真菌原生质体的制备

1)将新鲜的活化菌株JM-70S8和lg-9接种到50mL PDA液体培养基中，30℃培养58-60h；

2)在漏斗上面覆盖4层纱布，滤掉菌液，收集菌体，然后用无菌水冲洗3次；

3)用0.8M的MgSO 4溶液冲洗1次；

4)菌体置于无菌三角锥瓶中，悬浮于经过滤除菌的15mL 1％蜗牛酶+1％葡聚糖酶溶液，进行酶解，制备原生质体；