[发明专利]柞蚕核型多角体病毒基因组DNA线性化的方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种柞蚕核型多角体病毒基因组DNA线性化的方法及其试剂盒，属于生物技术领域。本发明公开了具有两个限制性内切酶酶切位点、可表达egfp的ApNPV突变株病毒ApNPV‑Δph/Avr II⁺/egfp⁺，利用限制性内切酶酶解消化，实现ApNPV基因组DNA的线性化。线性化后的病毒基因组DNA在柞蚕蛹体内产生新建重组病毒的能力比使用未线性化的病毒基因组DNA提高了36倍以上，新建重组病毒比例大于99％。通过重组病毒与突变株病毒的荧光信号差异，显著提高了重组病毒的筛选效率。本发明还公开了利用线性化的ApNPV基因组DNA制备柞蚕病毒表达系统应用试剂盒。本发明线性化ApNPV基因组DNA重组病毒产率高，筛选快速准确，试剂盒在生物技术领域的产品研发、科学基础研究等方面具有实用价值。

主权项

1.一种柞蚕核型多角体病毒基因组DNA线性化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计三对带有限制性内切酶酶切位点的引物，构建带有相应酶切位点的、可表达绿色荧光蛋白基因egfp的柞蚕病毒转移表达载体；(2)提取转移表达载体质粒DNA，并与ApNPV基因组DNA共转染Tn‑High Five昆虫细胞；(3)通过荧光显微镜筛选分离带有步骤(1)所述两个酶切位点的、可表达egfp的ApNPV突变株；(4)将步骤(3)中获得的ApNPV突变株病毒感染柞蚕蛹，取感染发病的柞蚕蛹体液，通过超速离心分离方法分离突变株病毒，再经蛋白酶K消化、酚抽提，大量制备突变株病毒基因组DNA；(5)用限制性内切酶酶切ApNPV突变株病毒基因组DNA，经分离，得到线性化ApNPV基因组DNA；所述步骤(1)中带有限制性内切酶酶切位点的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。